Внешнее возбуждение Нейроны Использование электрических и магнитных полей в одно- и двумерных культур

Общая цель этого протокола для электрической и магнитной стимуляции одномерных и двумерных культур состоит в том, чтобы эффективно использовать нейронные культуры в качестве сокращенной модели для стимуляции мозга, из которой мы можем извлечь понимание и важные параметры. Использование нашего протокола электростимуляции с одномерными культурами позволяет нам измерять конкретные параметры, связанные с нервным возбуждением, например, хронаксии и реобазу в различных отделах нейрона. Метод магнитной стимуляции позволяет сравнить влияние магнитных и электрических полей на нейронные культуры.

Эта модель также позволяет нам лучше диагностировать и лечить заболевания мозга. Мы предлагаем эффективный и простой метод культивирования паттерновых нейронных сетей в любом шаблоне проектирования, даже в одномерных сетях. Затем мы можем ориентировать электрические и изменяющиеся во времени магнитные поля относительно этих сетей, чтобы разделять и наблюдать вклады от различных отделов нейрона.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он не требует участия людей или животных моделей, что позволяет проводить обширный и исчерпывающий поиск правильных параметров для стимуляции нейронов. Демонстрировать процедуру будут Юрий Бурнишев, техник из моей лаборатории, и Ами Эйзен, аспирант лаборатории. Для начала подготовьте структурированные нейронные культуры путем посева нервных клеток на стеклянные покровные листы, частично покрытые слоем биоотторжения.

Для этого нужно очистить 25-миллиметровые покровные стекла. И с помощью распылительной машины покройте покровный лист биоотбраковочным слоем. Отрегулируйте параметры для процесса осаждения, чтобы создать слой, состоящий из тонкой хромовой пленки от шести до 10 ангстрем, которая обеспечивает стабильность покрытия, и слоя золота толщиной 30 ангстрем, обеспечивающего покрытию тиоловую реакционную способность.

После завершения процесса снимите покровное стекло с распылительной машины и осмотрите полученное покрытие. Затем соберите модифицированную систему перьевого плоттера, заменив чернильный наконечник плоттерного пера на острую металлическую иглу для травления. Поместите в плоттер резиновый лист, приклеенный к жесткой пластине, чтобы обеспечить прочную поверхность с высоким коэффициентом трения во время травления.

Затем отрегулируйте положение листа, нажимая кнопки, предусмотренные на плоттере. Как только резиновый лист будет на месте, нанесите на его поверхность небольшую каплю воды и нанесите на каплю предварительно покрытый покровный стекло. Далее, используя плоттер, протравите металлические слои путем повторяющихся царапин, создавая линии толщиной 200 микрометров для создания желаемых узоров.

Перед электростимуляцией поместите засеянный покровный стекло в камеру для визуализации. Для стимуляции клеток электрическим полем постоянного направления используют два параллельных электрода, разделенных на 11 миллиметров и расположенных на противоположных сторонах культуры, нанесенной на 13-миллиметровые покровные стекла. Затем соберите камеру для визуализации культуры и соответствующий держатель электродов таким образом, чтобы проволочные электроды были погружены во внеклеточную среду и располагались на один миллиметр выше культуры.

Затем подключите пару одиночных электродов к операционному усилителю, который усиливает сигнал от генератора. Подайте один импульс биполярного прямоугольного сигнала с коэффициентом заполнения 50% и амплитудой 22 вольта. Используйте биполярную волну без постоянного компонента, чтобы избежать электролиза, который может произойти на электродах.

Подайте импульс продолжительностью от 10 микросекунд до четырех миллисекунд, чтобы обеспечить эффективную стимуляцию и предотвратить повреждение клеток. Для стимуляции клеток электрическими полями изменяющегося направления используют две перпендикулярные пары электродов. Убедитесь, что две пары электродов, а также их клеммы питания и контроля полностью электрически изолированы друг от друга и плавают от заземления.

Чтобы изменить ориентацию электрического поля, изменяйте амплитуду напряжения, подаваемого на две пары электродов. Затем определите интенсивность и направление полученного поля путем сложения векторов. Чтобы создать вращательное поле с фиксированной амплитудой, подайте синусоидальную волну на одну пару электродов, одновременно подав на другую пару косинусную волну.

Чтобы начать магнитную стимуляцию, поместите под микроскоп культуру нейронов, выращенную в форме круглой формы. Стимулируйте культуру с помощью стандартной катушки круговой магнитной стимуляции и поддерживающего стимулятора, которые имеются в продаже. Чтобы стимулировать культуры с помощью нестандартных интенсивностей магнитного поля, подключите к специально изготовленному стимулятору катушку магнитной стимуляции.

Затем с помощью лазерной указки выровняйте центр культуры по центру катушки, чтобы обеспечить успешную стимуляцию. Отрегулируйте положение катушки так, чтобы она оставалась примерно на пять миллиметров выше центра культуры. После того, как катушка стимуляции будет правильно расположена, нагрузите стимулятор до потенциала до пяти киловольт.

Затем, используя переключатель высокого тока и высокого напряжения, разрядите ток высокого напряжения через катушку стимуляции, чтобы сгенерировать магнитный импульс, который стимулирует активность культивируемых нейронов. Наконец, установите катушку звукоснимателя в том же положении, что и культура нейронов, и измерьте интенсивность генерируемого магнитного поля. Эта схема показывает, что при подаче импульсов напряжения различной амплитуды на две пары электродов электрические поля могут быть ориентированы под любым углом без необходимости вручную поворачивать культуру.

Вот примеры регистрации переходных процессов кальция при электрической стимуляции при различных приложенных напряжениях. При применении постоянной длительности электрического поля число нейронов, которые возбуждаются и реагируют на электрическое поле, показывает кумулятивное распределение по Гауссу в зависимости от амплитуды напряжения. И это пример кривой «прочность-продолжительность», полученной при использовании этого протокола.

Для кольцевых культур, реагирующих на магнитное поле, вероятность успешной стимуляции растет с увеличением радиуса культуры. На этом графике показана связь между размером кольца и напряженностью магнитного поля. Наиболее удачные возбуждения культур заключаются в перекрытии пространства экспериментально доступной фазы и области высокой вероятности.

После освоения получение одномерных культур может быть выполнено в течение трех-четырех часов. При выполнении электрической и магнитной стимуляции важно помнить о том, что культура должна полностью восстановиться после этапа стимуляции и убедиться, что все оборудование находится в плавучем положении относительно электрического заземления. Следуя этой процедуре, можно решить и другие вопросы, такие как культивирование нейронов из разных областей мозга, измерение статистики, например, корковых нейронов.

Еще одна возможность – измерить параметры любого модельного нейрона заболевания. После своего развития эта техника может проложить путь к оптимизации силы и продолжительности, необходимых для эффективной и безопасной стимуляции мозга. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как создать любой желаемый узор из нейронных культур и уметь стимулировать их электрически или магнитно для изучения взаимодействий нейронов с электромагнитными полями.