РНК Pull-down процедура для определения целей РНК РНК, длиной некодирующих

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы идентифицировать в культивируемых клетках или в тканях РНК-молекулярных партнеров длинной некодирующей РНК, представляющей интерес. Этот метод может помочь расшифровать биологические функции длинной некодирующей РНК, предоставляя новые важные знания о регуляции РНК длинными некодирующими РНК. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он пригоден для большинства применений, поскольку мы оптимизировали его, во-первых, для нескольких длинных некодирующих РНК, а во-вторых, для культивируемых клеток и тканевых экстрактов.

Наш метод основан на сочетании двух предыдущих методов: ChIRP, что означает выделение хроматина путем очистки РНК, и CHART, который представляет собой анализ захвата и гибридизации мишеней РНК. Специфика нашего метода заключается в том, что олигонуклеотидные зонды были разработаны с использованием биоинформатического моделирования вторичной структуры длинной некодирующей РНК и его целью была идентификация РНК-мишеней. Демонстрировать процедуру будут два техника из моей команды, Бенедикт Бойе и Северина Гильен.

После культивирования клеток GH4C1 в соответствии с текстовым протоколом удалите среду из планшета для культивирования клеток и используйте один объем PBS для промывки клеток. Добавьте 10 миллилитров 1% PFA в PBS для фиксации клеток. Затем сшивают клетки при перемешивании при комнатной температуре в течение 10 минут.

Угасите действие PFA, добавив 1 миллилитр 1,25 молярного глицина и взбалтывайте образец при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем слейте раствор путем аспирации и используйте 10 миллилитров PBS для полоскания пластины два раза по пять минут каждый. Далее добавьте один миллилитр PBS, используйте скребок для сбора клеток, и перенесите их в центрифужную пробирку.

Вращайте образец при температуре 510 г и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Затем удалите как можно больше надосадочной жидкости и храните гранулы на неопределенный срок при температуре минус 80 градусов Цельсия. Чтобы провести тканевой кросслинкинг, погрузите пять миллиграммов свежеполученной ткани гипофиза мыши в 10-кратный объем 1% PFA в PBS и перемешивайте образец при комнатной температуре в течение 10 минут.

Погасите ПФА, добавив 0,05 миллилитра 1,25 молярного раствора глицина, и взбалтывайте ткань при комнатной температуре в течение пяти минут. Отсадите среду и используйте 0,5 миллилитра PBS для полоскания ткани два раза. После удаления как можно большего количества надосадочной жидкости храните сшитую ткань в течение неопределенного времени при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Подготовьте буфер для лизиса и затем лизируйте образцы без предварительного размораживания. Используйте буфер для ресуспендирования образцов примерно в одном миллилитре на 100 миллиграммов клеточной гранулы или ткани. Поместите лизированные образцы в водяную баню с температурой четыре градуса Цельсия и начните серию ультразвуковой обработки, оптимизированную в соответствии с текстовым протоколом.

Сразу после ультразвуковой обработки образцы центрифугируются при 12 000 g и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Затем переложите надосадочную жидкость в новые пробирки. Серия ультразвуковых исследований должна быть оптимизирована таким образом, чтобы она была достаточно эффективной для снижения вязкости ДНК без получения других фрагментированных РНК.

Чтобы выполнить гибридизацию на образцах, обработанных ультразвуком, добавьте два объема буфера для гибридизации в пробирки и вортекс. Перелейте 20 микролитров каждого образца в центрифужные пробирки и храните при температуре минус 20 градусов Цельсия. Добавьте к каждому образцу 100 пикомолев биотинилированных олигонуклеотидных зондов.

Затем инкубируйте образцы при умеренном перемешивании на вращателе пробирок при комнатной температуре в течение четырех-шести часов. После инкубации добавьте в образцы 50 микролитров магнитных шариков стрептавидина, дополненных 200 единицами на миллилитр раствора ингибитора РНКазы и коктейлем ингибитора протеазы 5 микролитров на миллилитр. Инкубируйте трубки при комнатной температуре при умеренном перемешивании на ротаторе трубок в течение ночи.

На следующий день проведите выделение РНК, поместив трубки на магнитную опору, и выбросьте надосадочную жидкость. Затем добавьте 900 микролитров буфера для промывки в бусины и поместите трубки на вращатель при комнатной температуре на пять минут. Затем поместите образцы на магнит, выбросьте буфер и повторите промывку пять раз.

После удаления окончательной промывки добавьте в образец 95 микролитров буфера Proteinase K и пять микролитров 20 миллиграммов на миллилитр протеиназы-K. Затем на льду разморозьте входные образцы и добавьте 75 микролитров буфера протеиназы К и пять микролитров протеиназы-К. Инкубируйте образцы при температуре 50 градусов Цельсия в течение 45 минут, затем при температуре 95 градусов Цельсия в течение 10 минут.

Охладите образцы на льду в течение трех минут, затем поместите их на магнит и соберите надосадочную жидкость, содержащую РНК, и выбросьте шарики. Используйте набор для очистки РНК для очистки РНК. Наконец, храните РНК при температуре минус 80 градусов Цельсия и проводите ОТ и кПЦР и конструируйте библиотеки ДНК в соответствии с текстовым протоколом.

На основе биоинформатического моделирования вторичной структуры некодирующей РНК, проиллюстрированной здесь, были разработаны зонды против двух некодирующих РНК, крысы Neat1 или Malat1 для культивируемых клеток GH4C1 и мышиный Neat1 для экстрактов гипофизарной ткани. Относительное обогащение Neat1 или Malat1 рассчитывали для неспецифических и специфичных зондов относительно входных образцов. На этом рисунке показана эффективность специфических зондов для снижения уровня Neat1 в клеточной линии гипофиза GH4C1 крысы и в экстрактах гипофизарной ткани мыши.

Когда протокол для специфических олигонуклеотидов или зондов СО был направлен на Malat1, был сгенерирован один эффективный зонд вместе с одним неэффективным зондом, который был отброшен. После вытягивания РНК и количественной ПЦР РНК, ассоциированные с Neat1 в клеточных экстрактах GH4C1, также были связаны с Neat1 в экстрактах гипофизарной ткани. Действительно, после снижения РНК Neat1 было обнаружено, что Malat1 является мишенью Neat1 как в клеточной линии GH4C1, так и в экстрактах тканей гипофиза мыши.

Кроме того, Neat1 был значительно обогащен после того, как было выполнено вытягивание РНК Malat1 с помощью зонда в клетках GH4C1. Тесная связь, выявленная между двумя некодирующими РНК, согласуется с потенциальной корегуляторной ролью Neat1 и Malat1, о которой свидетельствуют мыши с нокаутом Malat1, которые демонстрируют вариации экспрессии РНК Neat1. После освоения этот метод позволяет в течение двух или трех дней захватывать РНК-мишени желаемой длинной некодирующей РНК.

При использовании биоинформатического подхода важно разработать несколько антисмысловых зондов, а затем экспериментально сравнить их эффективность, поскольку эффективность зонда может быть изменена препаратами клеточного лизата. После этой процедуры может быть выполнено высокопроизводительное секвенирование РНК для того, чтобы обеспечить весь интерактом РНК длинной некодирующей РНК, представляющей интерес. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как захватывать РНК-партнеров длинной некодирующей РНК с помощью эффективных, специфичных зондов, которые гибридизуются с доступными областями длинной некодирующей РНК, как это определено биоинформатическим моделированием ее вторичной структуры.