Оценка подвижности нейронных стволовых клеток Использование агарозном геле основе микрожидкостных устройств

Здравствуйте, меня зовут Кевин Вон. Я магистрант инженерного факультета в Лаборатории биожидкостей Корнеллского университета. Сегодня я расскажу об использовании микрофлюидного устройства на основе agarose для изучения влияния EGF (эпидермального фактора роста) на нейральные стволовые клетки мыши.

Устройство состоит из трех микрофлюидных каналов шириной 150 микрон каждый. EGF закачивают в один из боковых каналов, а буфер — в другой боковой канал. Таким образом создается статический линейный химический градиент поперек центрального канала.

Поскольку EGF легко диффундирует через агарозный гель, нейрональные стволовые клетки высевают в центральный канал, а процесс их миграции контролируют с помощью микроскопа. Таким образом, устройства в основном состоят из верхнего слоя из плексигласа, в котором расположены все входные и выходные отверстия для подключения трубок. Под ним находится мембрана из агарозного геля, содержащая четыре структурированных устройства.

Это окружено спейсером из ПДМС, который обеспечивает постоянную толщину по всему устройству. ПДМС и гель собираются на предметном стекле, покрытом эктактином. Это способствует адгезии клеток к предметному стеклу.

Кроме того, стальная пластина используется для монтажа всего устройства, которое мы скрепляем винтами. Клеточная линия дикого типа была трансфицирована ретровирусным вектором для гиперэкспрессии рецептора EGF дикого типа, а клеточная линия delta была трансфицирована мутировавшей версией рецептора EGF, которая обеспечивает его конститутивную активность без лиганда EGF. Итак, я начну с описания процесса сборки нашего микрофлюидного устройства.

Сначала я поместил ПДМС-распорку вокруг рельефных элементов кремниевых микроканалов в наших матрицах. Теперь я отвешиваю 0,3 г agarose. Затем я возьму 10 мл среды, не зависящей от CO2, и добавлю её к agarose.

Теперь я буду пипетировать раствор вверх-вниз, чтобы смешать порошок agros со средой, не зависящей от CO2. Теперь мы готовы к использованию микроволновой печи. Как вы видите, agros теперь разжижен, хотя несколько гранул все еще остаются.

Я попробую аккуратно перемешать содержимое круговыми движениями, чтобы растворить гранулу и удалить пузырьки воздуха. Теперь я выливаю расплавленный agarose на рельефные структуры кремниевой матрицы, после чего беру стерильное предметное стекло и накладываю его поверх проставки из PDMS. Я помещаю его под углом, чтобы вытеснить большую часть пузырьков воздуха из agarose-геля.

Я приложил давление и буду продолжать оказывать его до тех пор, пока оболочка из agarose не затвердеет. Спустя одну-две минуты она затвердела. Теперь я удалю излишки agarose с предметного стекла.

Следующий шаг — осторожно сдвинуть предметное стекло; это стекло можно утилизировать. Теперь я постараюсь аккуратно перенести паттерн агарозы на предметное стекло, которое я предварительно покрыл фибронектином. Я использую этот стерильный пластиковый лист, чтобы помочь мне приподнять паттерн агарозы вместе с разделителем из PDMS, после чего я перенесу паттерн агарозы каналами вниз на стекло.

Теперь, когда устройство надежно зафиксировано на предметном стекле, я проделаю отверстия в отдельных резервуарах, чтобы пластиковый коллектор имел доступ к каналам. Для этого я воспользуюсь небольшим металлическим пробойником. Теперь процесс создания отверстий в устройстве завершен.

Я добавлю 500 µL среды, не зависящей от CO2, чтобы предотвратить высыхание микроканалов, и оставлю её на одну-две минуты. Спустя одну-две минуты я удалю излишки среды, после чего совмещу отверстия, пробитые в паттерне агарозы, с входным и выходным отверстиями плексигласового коллектора. Как только отверстия будут совмещены, я плотно прижму их для создания надежного уплотнения.

Теперь я помещаю плексигласовый коллектор на стальные крепления и аккуратно зажимаю устройство с помощью винтов. Я очень осторожен, чтобы не перетянуть винты, так как это может деформировать каналы; я закручиваю винты по часовой стрелке, чтобы предотвратить смещение agarose gel внутри. Я наберу 1 mL среды и буду использовать этот шприц для тестирования устройства.

Как видите, я ввожу жидкость в каждый микроканал и проверяю, выходит ли она из каждого выпускного отверстия. В данный момент я поместил собранное устройство в климатическую камеру микроскопа. Температура в ней поддерживается на уровне 37 °C, чтобы прогреть устройство и подготовить его к посеву клеток.

Как видите, я уже пропустил две трубки перистальтического насоса через установку. В настоящее время я промываю трубки раствором PBS в preparation к проведению экспериментов. Теперь мы приступим к настройке трубок.

Я продену трубки перистальтического насоса через колпачки с заранее пробитыми в них отверстиями. На каждой трубке есть определенное количество зазубрин, чтобы я мог идентифицировать как входное, так и выходное отверстие трубки. Таким образом, в трубку с четырьмя зазубринами будет подаваться 10 ng/ml.

Теперь закрепим трубки с раствором EGF на устройстве. Я прикреплю их к каждому устройству в соответствии с количеством имеющихся на нем выемок, что соответствует объему забираемого раствора.

Теперь я подсоединяю выходную трубку. Мы используем прозрачную трубку Tigon, чтобы убедиться, что среда действительно течет по выходной трубке и в канале нет засоров. Теперь я запущу перистальтические насосы.

Теперь я приступлю к процедуре посева клеток в центральный канал. Сначала я удалю излишки среды из сенсорного канала. Теперь я вижу клетки.

Клетки уже находятся во взвешенном состоянии в среде, не зависящей от CO2. Я внес 60 мкл во входное отверстие центрального канала и 20 мкл в выходное отверстие. Предполагается, что клетки будут распределены за счет потока, вызванного гравитацией.

Я повторю эту процедуру для двух других чувствительных каналов, а затем мы посмотрим на результат под микроскопом, чтобы проверить, успешно ли произошло осаждение клеток. Теперь клетки прикрепились к предметному стеклу, и через несколько минут они начнут распластываться и приобретать свою уникальную морфологию. Таким образом, сегодня мы рассмотрели сборку самого устройства, приготовление реагентов и методы микроскопии, которые я использую для визуализации миграции клеток внутри устройства.

В заключение мы надеемся, что данное устройство найдет гораздо более широкое применение, в частности, в клинической практике. Таким образом, на рисунке 1 по горизонтали показаны траектории клеток C 17.2, а по вертикали — возрастающие концентрации EGF.

На графике представлены траектории различных штаммов клеток C 17.2, использованных в наших экспериментах при одинаковой концентрации EGF. Данные для родительских клеток показывают пик подвижности при градиенте концентрации EGF 10 ng/ml, что указывает на насыщение рецепторов лигандом при более высокой концентрации EGF. Данные для дикого типа демонстрируют увеличение подвижности при концентрации EGF 100 ng/ml.

Это указывает на то, что рецепторы не насыщаются при более высоких концентрациях EGF. Это объясняется тем, что клетки были сконструированы для гиперэкспрессии рецептора EGF. Наконец, данные по клеточной линии delta показывают, что подвижность клеток практически не зависит от концентрации EGF.

Это также было ожидаемо, поскольку мутировавшие рецепторы EGF были разработаны таким образом, чтобы активироваться независимо от присутствия EGF.