Метод 2-Фотон изображений кровотока в коре головного мозга через черепной Window

Возможность визуализации церебральных сосудов и регистрации динамики кровотока в интактном мозге живых грызунов представляет собой мощный метод, который может быть применен для изучения ишемии головного мозга или нормальной физиологии мозга. В данной работе мы продемонстрируем использование двухфотонной микроскопии для визуализации динамики кровотока в неокортексе живых мышей с применением флуоресцентных красителей, введенных в хвостовую вену. Этот метод был первоначально разработан Дэвидом Кляйнфельдом и Винфредом Данком.

Здравствуйте, я Рикардо Мота из лаборатории Карлоса Портера Кайо кафедры неврологии Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе. В предыдущем видео мы продемонстрировали метод имплантации краниального окна для проведения долгосрочных экспериментов по визуализации in vivo. Сегодня мы покажем вам процедуру визуализации динамики кровотока в коре головного мозга через краниальное окно.

Данная подготовка очень полезна, так как она позволяет получать изображения глубоких отделов мозга с помощью двухфотонной лазерной микроскопии. Итак, приступим. Для визуализации церебральной сосудистой сети животным необходимо ввести флуоресцентный краситель внутривенно.

Мы используем красители, конъюгированные с декстраном, поскольку фрагмент декстрана препятствует прохождению красителя через гематоэнцефалический барьер и его утечке из кровеносных сосудов. Мышей анестезируют изофлураном: 4% для индукции и от 1,5 до 2% во время инъекции. Затем хвост дезинфицируют тремя тампонами с 70% спиртом, и с помощью иглы 26G через хвостовую вену вводят от 75 до 100 µL 5% раствора Rhodamine Dextran, растворенного в физиологическом растворе.

На среднем участке хвола животных можно проводить визуализацию сразу после инъекции в хвостовую вену и до тех пор, пока краситель не будет выведен с мочой, которая окрасится в розовый цвет при использовании красителя ERO domine. Примерно через два часа после инъекции флуоресцентного красителя Dexter мышь подвергают анестезии изофлураном: 4% для индукции и от 1 до 1,5% для визуализации. Мышь надежно фиксируют с помощью титановой планки к предметному столику микроскопа, который оснащен терморегулируемой грелкой для поддержания температуры тела животного.

Для поддержания увлажненности глаз наносят глазную мазь. Покровное стекло краниального окна очищают 70% алкоголем. Окно располагают параллельно фокальной плоскости и центрируют в поле зрения.

С помощью объектива с четырехкратным увеличением рекомендуется сфотографировать сосуды поверхности мозга на цифровую камеру. Этот снимок будет использоваться в качестве опорного изображения в последующих сеансах визуализации для многократного поиска одного и того же участка изображения изо дня в день. Затем четырехкратный объектив заменяют на водопогружной объектив с 40-кратным увеличением.

Не перемещая предметный столик, делают цифровой снимок поля зрения. Снова обнуляют координаты манипулятора столика. В качестве программного обеспечения для захвата изображений используют scan image.

Данный программный модуль был написан в MATLAB Томом Полом Рудо и Бернардо Сабатини в лаборатории Карлса Вото. Далее мы включаем все остальное оборудование: лазер, измеритель мощности, фотоэлектронные умножители, усилители и так далее. Область окна, пригодная для визуализации, подвергается краткому сканированию при малом увеличении для поиска наиболее подходящих участков.

После их идентификации выполняется серия снимков выбранной области при малом увеличении, и ее координаты XY фиксируются для записи динамики кровотока в мелких сосудах или капиллярах. Мы используем линейное сканирование вдоль участка интересующего сосуда длиной не менее 40 microns. Эти одиночные проходы продолжительностью одну секунду осуществляются с использованием минимально возможной мощности лазера; координаты и угол сканирования записываются.

После завершения сеанса визуализации животное перемещают в теплую камеру для восстановления после анестезии. Здесь мы представляем стек из ста изображений, полученных с помощью двухфотонного микроскопа с шагом в 5 мкм через краниальное окно, установленное над соматосенсорной корой пятимесячной мыши, которой в хвостовую вену был введен rhodamine dextran. Эта последовательность изображений демонстрирует сложную сеть крупных и мелких кровеносных сосудов, включая капилляры.

Мы только что продемонстрировали метод визуализации динамики кровотока in vivo через краниальное окно. Это чрезвычайно эффективный метод визуализации динамики мозгового кровотока в сосудах коры головного мозга, который, например, позволяет исследовать изменения кровотока после инсульта. С помощью повторных инъекций флуоресцентного красителя в хвостовую вену можно проводить многократную визуализацию в разные моменты времени.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости работы в максимально чистых и стерильных условиях, а также о необходимости твердости руки. Итак, на этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в вашем эксперименте.