Визуализация и количественная оценка межмолекулярного парирования баз РНК in vitro кластеров РНК с использованием репортеров РНК с разделёнными брокколи

Мы применяем репортерный анализ РНК на разделённой брокколи для обнаружения и количественной оценки межмолекулярного спарения оснований в РНК-кластерах in vitro. Химические исследования и симуляции указывают на взаимодействия РНК, но не могут их напрямую измерить. Этот протокол позволяет проводить прямую и точную оценку внутри РНК-кластеров.

После подготовки ДНК-шаблонов для in vitro транскрипции РНК протрите рабочую поверхность, стойки для трубок и пипетки раствором для дезактивации рибонуклеазой. Используйте фильтрованные насадки без рибонуклеазы для всех этапов пипетирования. Разморозить буфер реакции и растворы нуклеотидов, поставляемые в комплекте транскрипции, вместе с уридинтрифосфатом цианином 5, или UTP-Cy5, на льду.

Центрифугуйте все трубки при 2 000 г в течение двух секунд перед использованием. Затем вычислите количество основ тимина в ДНК. Определить необходимые объемы UTP и UTP-Cy5 для транскрипционной реакции объёмом 20 микролитров, сохраняя при этом единую плотность маркировки для всех видов РНК.

Далее подготовьте транскрипционную реакцию объемом 20 микролитров, объединив представленные реагенты. Тщательно перемешайте, поднимая и опуская пипе, и центрифугуйте при 2 000 г в течение двух секунд. После инкубации реакции при 37 градусах Цельсия в течение шести часов добавьте один микролитр дезоксирибонуклеазы, поставляемой в комплекте, тщательно перемешайте пипеткой и снова центрифугайте.

Затем инкубировать при 37 градусах Цельсия ещё 15 минут. Перенесите реакцию в трубку объёмом 1,5 миллилитра. Добавьте 115 микролитров воды без нуклеазы и 15 микролитров раствора аммоний-ацетата, который поставляется в комплекте.

После смешивания центрифугуйте раствор при температуре 2 000 г в течение двух секунд. Затем добавьте 150 микролитров фенолхлороформ в пробирку и аккуратно перемешайте, чтобы соединить фазы. Центрифугу при 16 000 г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия.

Затем переведите верхнюю водную фазу в новую трубку. Добавьте равный объём хлороформ в перенесённый раствор и тщательно перемешайте для правильного взаимодействия между фазами. Теперь центрифугуйте при 16 000 г в течение двух минут при 4 градусах Цельсия и повторите процесс фазового разделения ещё раз.

Затем перенесите водный слой примерно 100–150 микролитров в новую трубку. Добавьте 900 микролитров изопропанола и тщательно перемешайте. После алицитирования раствора в отдельных пробирках храните образцы при минус 20 градусах Цельсия на ночь или до месяца.

Центрифугуйте образец РНК в изопропаноле при 16 000 г в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия. Аккуратно удаляйте изопропанол, не нарушая РНК-гранулу. Затем добавьте в гранулу один миллилитр 70% этанола, приготовленного в воде без нуклеазы.

Центрифуга при 16 000 г в течение двух минут при 4 градусах Цельсия. После удаления этанола добавьте в трубку один миллилитр 70%этанола, приготовленного в воде без нуклеаз, и повторите центрифугирование. Во время финальной промывки этанолом удалите большую часть этанола с помощью пипетки объемом 1 000 микролитров.

Кратко центрифугуйте при 2 000 г в течение двух секунд в настольной мини-центрифуге и удалите оставшийся этанол с помощью 20-микролитровой пипетки. После высыхания РНК-гранулы восстановите её в 20 микролитрах воды без нуклеаз. Держите образец на льду и защищайте его от света.

С помощью микрообъёмного спектрофотометра измеряйте концентрацию и чистоту РНК. Убедитесь, что коэффициент поглощения при 260 на 280 нанометрах примерно равен 2,0, а коэффициент при 260 на 230 нанометрах — больше 2,0. Разморозить пробирку раствора спермина 100 миллимоляров и 50% полиэтиленгликоля 8 000 на льду.

Свежо подготовьте буфер для перескладывания РНК 10X, объединив показанные компоненты. После тщательного смешивания компонентов с помощью пипета центрифугуйте при 2 000 г в настольную мини-центрифугу на две секунды. Для условия ко-сворачивания в ПЦР-трубке объемом 200 микролитров сочетайте in vitro транскрипционированную РНК с верхней или нижней последовательностью, буфер для сворачивания РНК и воду без нуклеазы.

Тщательно перемешивайте, проводя пипеной вверх-вниз и центрифугой, как было показано ранее. Нагрейте образец при 90 градусах Цельсия в течение двух минут. Немедленно переведите образец до комнатной температуры.

Защитите от света и инкубуйте в течение одного часа. Для отдельного сгибания нагрейте образец РНК в ПЦР-пробирке объемом 200 микролитров, а затем сразу поставьте его на лёд минимум на 15 минут. В ПЦР-пробирке объемом 200 микролитров объединяйте in vitro транскрибированную РНК, несущую либо верхнюю, либо нижнюю последовательность, 10-кратный буфер для сворачивания РНК и воду без нуклеазы.

Инкубировать реакцию при комнатной температуре в течение 30 минут, защищая от света. Теперь объедините образцы РНК с верхней и нижней последовательностями в одну ПЦР-пробирку и тщательно перемешайте, пробирая вверх и вниз. Центрифугу при 2 000 г в течение двух секунд в настольной мини-центрифугах.

Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Для обоих состояний добавьте шесть микролитров премикса 100 миллимолярных спермина и 50% полиэтиленгликоля 8 000. После смешивания центрифугите при 2 000 г в настольную мини-центрифугу на две секунды.

Теперь смешайте два микролитра одного миллимолярного DFHBI-1T с реакцией и снова центрифугайте. Загрузите реакцию в стеклянное стекло с крышкой. Инкубировать камеру при комнатной температуре в течение четырёх часов в темноте с крышкой, чтобы минимизировать испарение.

Загрузите стекло в стеклянной камере на ступень микроскопа. Включите лазер, затем используйте окуляри, чтобы найти и сфокусироваться на образце. Настройте микроскоп так, чтобы каждый интересующий участок сначала показал цианиновый 5-канал на каждой плоскости Z.

Затем сфотографируйте тот же интересующий регион с помощью зелёного флуоресцентного белкового канала. Установите время экспозиции на 500 миллисекунд для всех каналов. Затем установите мощность лазера на 80% для зелёного флуоресцентного белкового канала и 40% для цианинового 5-канала.

Используя Z-шаг размером 150 нанометров, сфотографируйте область скольжения крышки вне реакционной капли при комнатной температуре. Затем количественно измерите межмолекулярные пары оснований с помощью программного обеспечения для анализа изображений. При индукции кластеризации РНК обе РНК образовывали кластеры по отдельности или вместе.

Флуоресценция DFHBI-1T внутри РНК-кластеров была значительно ниже только для верхних или нижних РНК по сравнению с условием совместного сворачивания. В отдельном условии сгибания нормализованный сигнал DFHBI-1T составлял 0,031, что сопоставимо с базовыми уровнями, наблюдаемыми только сверху или снизу. Шу-топ, шу-боттом, шу-анти-топ и шу-анти-боттом по отдельности демонстрировали минимальную флуоресценцию DFHBI-1T.

Совместное складывание shu-top с shu-bottom или shu-anti-top с shu-anti-bottom обеспечивало более высокий сигнал DFHBI-1T, чем отдельное складывание. Совместное сворачивание шу-топа и шу-боттома привело к 5,63-кратному увеличению нормированной флуоресценции DFHBI-1T. Отдельное складывание shu-top и shu-bottom показало увеличение всего в 1,04 раза, сопоставимого с базовыми уровнями.

Shu-top, смешанный с shu-anti-bottom и shu-anti-top, смешанный с shu-bottom, демонстрировал более высокую флуоресценцию DFHBI-1T, чем пары одинаковой ориентации при обоих условиях складывания. Совместное сгибание шу-топа с шу-анти-боттом и шу-анти-топом с шу-боттом привело к 61,86 и 82,60-кратному увеличению флуоресценции DFHBI-1T соответственно. Отдельное складывание этих смешанных пар дало меньшие увеличения — 2,69 и 4,94 раза соответственно.

Самый важный момент заключается в том, что устойчивая генерация сигнала может потребовать реагентов с переполненностью, тогда как чувствительность зависит от эффективной димеризации и сгибания РНК расщеплённых брокколи. Этот анализ дополняет подходы РНК pull down и гель-электрофорез для изучения межмолекулярных пар оснований в РНК-кластерах. Этот анализ позволяет изучать влияние РНК-последовательностей, геликаз и ионов на межмолекулярное спаривание оснований внутри РНК-кластеров.