В пробирке Дифференциация Мышь эмбриональных стволовых (MES) ячеек с использованием висячей капли Метод

Стволовые клетки обладают удивительной способностью развиваться во многие различные типы клеток организма, выполняя роль своеобразной системы восстановления. Теоретически они могут делиться неограниченно, восполняя популяцию других клеток.

Когда стволовая клетка делится, каждая новая клетка может либо остаться стволовой, либо стать клеткой другого типа с более специализированной функцией. Это перспективное направление науки побуждает ученых исследовать возможность применения клеточной терапии для лечения заболеваний in vitro. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток происходит, когда клеткам позволяют агрегировать в суспензионной культуре.

В отсутствие эмбриональных фибробластов мыши и лейкозного ингибирующего фактора такие клеточные агрегаты называют эмбриональными тельцами. Метод висячей капли является эффективной процедурой для дифференцировки стволовых клеток в эмбриональные тельца in vitro. Здравствуйте, меня зовут Ша Джуань, я из отделения сердечно-сосудистой медицины Стэнфордского университета.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру индивидуальной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в эмбриональные тельца с использованием метода «висячей капли». Обычно мы применяем этот метод для дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в кардиомиоциты. Данная процедура включает в себя следующие этапы: подготовку суспензии одиночных эмбриональных стволовых клеток, создание культур в висячих каплях, перенос культур из висячих капель на планшеты с ультранизким уровнем адгезии и высев эмбриональных телец на планшеты, покрытые желатином.

Итак, приступим. Первым этапом процедуры является подготовка суспензии отдельных эмбриональных стволовых клеток. Поскольку мы культивируем недифференцированные эмбриональные стволовые клетки, выращивая их на эмбриональных фибробластах мыши, нам необходимо отсоединить клетки и отделить их от фибробластов.

Для этого клетки трипсинизируют по стандартной процедуре. После завершения обработки трипсином добавьте среду для эмбриональных стволовых клеток мыши, чтобы нейтрализовать трипсин. Затем перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл.

Затем разрушьте колонии клеток, прокачивая их пипеткой вверх-вниз у дна пробирки до получения однородной суспензии клеток без видимых агрегатов. Затем центрифугируйте клетки при 1000 RPM в течение пяти минут. После центрифугирования аспирируйте супернатант и ресуспендируйте клетки в 10 mL среды для мышиных ЭСК (mouse ES cell Medium).

Перенесите клеточную суспензию в флакон T 75, предварительно обработанный 0,1% желатином, и инкубируйте при 37 °C с 5% CO2 в течение одного часа. Через один час фибробласты прикрепятся к поверхности флакона, в то время как стволовые клетки останутся в среде. Соберите среду с помощью пипетки для извлечения стволовых клеток.

Центрифугируйте клетки при 1000 об/мин в течение пяти минут и аспирируйте среду. Затем добавьте еще 10 мл среды для дифференцировки и ресуспендируйте клетки путем многократного пипетирования до получения однородной суспензии. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.

Теперь мы готовы к культивированию клеточной суспензии методом «висячей капли». Для начала культивирования методом «висячей капли» используйте среду для дифференцировки, чтобы разбавить суспензию стволовых клеток до концентрации 500 клеток на 20 µL. Затем переверните крышку чашки для культивирования тканей диаметром 150 мм.

Затем перенесите 20 µL клеточной суспензии на внутреннюю поверхность крышки планшета. С помощью многоканального дозатора добавьте 10 µL PBS в лунки планшета. Быстро переверните крышку планшета и аккуратно поместите ее на планшет для формирования висячих капель.

После того как крышка планшета будет установлена, осторожно перенесите планшет в инкубатор для культивирования. Клетки оставляют в покое на два дня. По завершении инкубации мы приступим к переносу культуры из висячих капель на планшеты с ультранизкой адгезией.

Через два дня осторожно переверните крышку планшета, затем аспирируйте 180 µL свежей среды для дифференцировки и капните по несколько капель в 96-луночный планшет со сверхнизкой адгезией. Затем соберите капли пипеткой и поочередно перенесите их в 96-луночный планшет. Поместите планшеты в инкубатор на три дня, не тревожа их.

Эмбриональные тельца продолжат расти, принимая форму шара. По завершении инкубации мы будем готовы к высеву эмбриональных телец на планшет, чтобы способствовать их дальнейшей дифференцировке.

Мы переносим их в 48-луночный планшет с желатиновым покрытием. Для этого сначала каждую лунку планшета покрывают 300 µL 0,1% желатина. После добавления желатина планшет инкубируют в течение ночи при 37 °C.

На следующий день аспирируйте желатин из 48-луночного планшета. Затем добавьте по 300 µL дифференцировочной среды в каждую лунку. После этого поочередно перенесите тела эмбрионов из 96-луночного планшета в лунки 48-луночного планшета с желатиновым покрытием.

Обычно мы меняем среду на следующий день, а затем через день для поддержания жизнеспособности клеток. Мы используем этот метод для поиска более эффективных протоколов дифференцировки эмбриональных стволовых клеток. На примере кардиомиоцитов мы только что продемонстрировали, как проводить дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro с использованием метода висячей капли.

Данный метод эффективен, поскольку круглое дно висячей капли способствует агрегации эмбриональных стволовых клеток, создавая тем самым благоприятную среду для формирования эмбриоидных телец. При выполнении этой процедуры важно помнить, что количество эмбриональных стволовых клеток, агрегированных в висячей капле, можно регулировать, изменяя концентрацию клеток в исходной клеточной суспензии. На этом всё.

Спасибо за просмотр. Желаем удачи в проведении вашего эксперимента.