Эффективное Дифференциация эмбриональных стволовых клеток мыши в моторные нейроны

Общая цель данной процедуры заключается в дифференцировке эмбриональных стволовых клеток мыши в мотонейроны. Сначала культивируют эмбриональные стволовые клетки мыши на первичных эмбриональных фибробластах мыши с добавлением лейкозного ингибирующего фактора. Затем процесс нейрализации усиливают путем добавления noggin, bFGF и FGF8; спецификацию мотонейронов индуцируют инкубацией с ретиноевой кислотой и агонистом рецептора smoothened, после чего следуют этапы удлинения аксонов и созревания мотонейронов.

Наконец, используйте иммунофлуоресцентную микроскопию для исследования дифференцированных клеток МЭСК, которые демонстрируют сильную флуоресценцию GFP. Получение большого количества мотонейронов облегчило исследование заболеваний мотонейронов по сравнению с существующими на данный момент протоколами. Данный подход к дифференцировке эмбриональных стволовых клеток мыши в мотонейроны является более эффективным. Этот метод может дать новое представление о спинальной мышечной атрофии.

Этот метод также может быть применен при других заболеваниях моторных нейронов, таких как боковой амиотрофический склероз. Для посева первичных эмбриональных фибробластов мыши обработайте четыре чашки для культивирования тканей диаметром 100 мм 8 мл 0,1% раствора желатина. Через 30 минут при комнатной температуре удалите излишки жидкости. Затем разведите один флакон митомицина C в активированных PMEF в 40 мл среды PMEF, распределите по четырем чашкам и культивируйте до одной недели.

Затем разморозьте один флакон клеток MES на водяной бане при 37 °C. Промойте клетки пятью миллилитрами среды E ES в пробирке объемом 15 мл. После этого центрифугируйте при 800 RPM в течение пяти минут.

Отожмите супернатант и ресуспендируйте клетки MES в 20 миллилитрах среды ES со свежедобавленным лейкемическим ингибирующим фактором. Затем удалите 10 миллилитров среды из культур PMEF и замените их 10 миллилитрами суспензии клеток ES HBG three. Наблюдайте за развитием клеток MES с течением времени: от небольших колоний через 24 часа до колоний диаметром примерно 100 микрометров через 72 часа после посева.

Ежедневно заменяйте среду для поддержания пролиферации клеток при индукции клеток MES. Дифференцировка в моторные нейроны. Эмбриональные стволовые клетки мыши должны быть сначала отделены от фидерных клеток PMEF, а затем в день индукции культивированы в условиях суспензии.

Для каждой культуры ЭСК в чашке 100 мм подготовьте T-флакон объемом 50 мл, покрытый 0,1% желатином. Через 30 минут при комнатной температуре удалите излишки желатина и трижды промойте флакон PBS. Затем аккуратно аспирируйте среду из культуры ЭСК, стараясь не сместить слабо прикрепленные колонии. После этого один раз промойте культуру 10 мл PBS.

Теперь, чтобы отделить клетки MES от PMEF, добавьте три миллилитра 0.25% трип신-ЭДТА и инкубируйте в течение трех-пяти минут при 37 °C, убедившись, что стволовые клетки и PMEF отсоединились от планшета. Затем добавьте 15 миллилитров свежей среды для ЭСК и разрушьте колонии путем пипетирования.

Перенесите клеточную суспензию в подготовленный флакон T 50 с желатиновым покрытием и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C, чтобы PFS прикрепились к желатинизированной поверхности. Затем соберите плавающие клетки MES в пробирку объемом 50 мл и осадите их путем центрифугирования. Ресуспендируйте клетки в 10 мл среды для нейрональной дифференцировки.

Проведите подсчет клеток в среде с помощью гемоцитометра, затем высейте их в 100-миллиметровую чашку для суспензионного культивирования для дифференцировки. В первый день с помощью микроскопии убедитесь, что клетки MES образовали небольшие плавающие агрегаты, называемые эмбриональными тельцами. Чтобы удалить любые оставшиеся PMEF, прикрепившиеся к чашке, перенесите суспензию клеток ES и среду в пробирку объемом 15 мл, затем центрифугируйте при 500 RPM в течение трех минут.

Для сбора эмбриоидных телец осторожно аспирируйте среду, добавьте 10 мл свежей среды для нейральной дифференцировки к осажденным ЭТ, а затем высейте клетки в новую чашку для бактериального культивирования на 24 часа для дифференцировки. На второй день осторожно перемешайте содержимое чашки и перенесите среду с ЭТ в пробирку объемом 15 мл. Дайте ЭТ осесть под действием силы тяжести, затем осторожно аспирируйте среду и ресуспендируйте ЭТ в 10 мл среды для дифференцировки мотонейронов.

Культивируйте EBS в новой чашке для бактерий в течение пяти дней в условиях дифференцировки. На седьмой день убедитесь, что диаметр EBS составляет примерно 150–200 µm и при дифференцировке наблюдаются сильные сигналы GFP. На пятый день, за два дня до диссоциации EBS, поместите круглые покровные стекла диаметром 12 мм на дно 24-луночного планшета.

Затем добавьте 0,5 мл поли-DL-орнитина в концентрации 100 мкг/мл и инкубируйте при температуре 4 °C в течение ночи. Аспирируйте поли-DL-орнитин, высушите планшеты и покровные стекла на воздухе в ламинарном шкафу для культур тканей. Промойте лунки планшета дважды дистиллированной водой три раза.

Оставьте подложки подсадочного стекла подсохнуть на воздухе. Приготовьте свежий разведение ламинина мыши в концентрации 2 µg/mL в 5 mL ледяного 1X PBS. Добавьте по 0,5 mL в каждую лунку и инкубируйте при температуре 4 °C в течение ночи.

При дифференцировке дважды промойте PBS. На седьмой день соберите EBS в пробирку объемом 15 мл и дайте EBS осесть под действием силы тяжести. После четырех промывок PBS осторожно добавьте к EBS 1 мл ACU max, перемешайте и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре, затем аспирируйте излишки ACU max, покрывающие EBS.

Теперь добавьте 3 мл среды MND и диссоциируйте EBS, примерно 20 раз пропипетировав суспензию с помощью микропипетки Эйнора на 1 мл, затем инкубируйте в течение двух минут при комнатной температуре и пропустите клеточную суспензию через колпачок с клеточным фильтром в пробирку 12 × 75 мм. Повторите этот этап диссоциации с оставшимися комками и клетками, задержанными фильтром, чтобы увеличить выход одиночных клеток в итоговой суспензии одиночных клеток объемом 6 мл. Осторожно перемешайте суспензию одиночных клеток и подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра, затем разведите клетки в полной среде MND до плотности 2 × 10⁵ клеток/мл и высейте на планшет.

0.5 мл клеточной суспензии в каждую лунку подготовленных 24-луночных планшетов, содержащих покровные стекла с покрытием из поли-DL-орнинина и ламинина. Через два дня дифференцированные клетки образуют длинные нейриты. В данной культуре HBG3 представляет собой линию ЭСК, полученную от трансгенной мыши, экспрессирующей EGFP под контролем специфического для моторных нейронов промотора HB9, с определенным протоколом дифференцировки.

Клетки MES могут быть использованы для получения моторных нейронов. Недифференцированные клетки MES образуют округлые колонии на поверхности фидерного слоя фибробластов. Они характеризуются слабой экспрессией GFP.

Эти клетки MES были отделены от фидерных слоев и культивировались в чашках с низкой адгезией для формирования эмбриональных телец. Дифференцированные клетки MES проявляли сильную флуоресценцию GFP после седьмого дня. Дифференцированные EBS были диссоциированы и высеяны на планшеты, покрытые поли-DL-орнитином и ламинином.

Через два дня культивирования дифференцированные клетки развивают длинные нейриты, отходящие от тел посеянных клеток; моторные нейроны, полученные из клеток MES, могут быть идентифицированы с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания. Эти GFP-положительные клетки экспрессируют пан-нейрональный маркер нейрофиламент и два специфических маркера моторных нейронов: Islet 1 и холин-ацетилтрансферазу, в то время как DPI окрашивает ядра.

Наш двухэтапный протокол дифференцировки представляет собой эффективный способ дифференцировки клеток MES в спинальные мотонейроны. После просмотра этого видео вы должны понять, как эффективно дифференцировать эмбриональные стволовые клетки мыши в мотонейроны. В заключение следует помнить, что высокое качество эмбриональных стволовых клеток мыши является наиболее критическим параметром для эффективного получения мотонейронов.