Mikrovasküler Endotel Fizyolojik E-selektin aracılığı ile Lökosit Rolling Analizi

Bu video, endotelyal hücre yüzeylerinde lökosit yuvarlanmasını tetikleyen faktörlerin incelenmesi için paralel plak akış odası analizini göstermektedir. Endotelyal hücre monokatmanları, S selektin ekspresyonunu artırmak için proinflamatuar sitokin IL one beta ile stimüle edilir. Ardından paralel plak akış odası endotelyal hücrelerin üzerine yerleştirilir ve S selektin pozitif lökositler monokatman üzerinden infüze edilir.

Haznedeki hücresel etkileşimler, böylece postkapiller lökosit adezyonundakine benzer bir kayma stresine maruz bırakılır. Yuvarlanma olayları, NIS elementleri kullanılarak yakalanır, sayılır ve E-selektin bağımsızlığı için analiz edilir. Merhaba, ben George Weis; Brigham and Women's Hospital, Harvard Tıp Fakültesi, Dermatoloji Bölümü'nde Dr. Charles de Nitro'nun laboratuvarındayım.

Bugün sizlere, fizyolojik kan akış koşulları altında insan lökositlerinin insan kemik iliği endotel hücrelerine yapışmasında E selektin ve E selektin ligandlarının rolünü analiz eden bir prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, kan damarlarının iç yüzeyini döşeyen endotel hücrelerine beyaz kan hücrelerinin veya metastatik kanser hücrelerinin yapışmasını başlatan hücre yüzey moleküllerinin rolünü incelemek için kullanıyoruz. Bu adezyon olayı, bir bowling topunun pistte yuvarlanmasına benzer bir yuvarlanma davranışı ile karakterize edilir.

Hadi başlayalım. Bu prosedürdeki ilk adım, akış hücresini kaplayacak olan endotel hücrelerini hazırlamaktır. Bu protokolde, insan kemik iliğinden türetilmiş H-B-M-E-C 60 hücreleri kullanılmaktadır.

Mikrovaskülatür kültür kapları, hazırlık amacıyla önceden fibronectin ile kaplanmalıdır; bunun için 35 ml doku kültürü kaplarını, ml başına 20 µg fibronectin içeren PBS ile inkübe edin. Bunlar, 4 °C'de gece boyunca veya 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edilebilir. H-B-M-E-C 60 hücrelerini medium 1 99 içerisinde süspanse edin ve her kapta 10⁵ hücre olacak şekilde ekim yaparak kültürleri %90'ın üzerinde konfluense ulaşana kadar büyütün.

E-selectin ve ekspresyonunu yukarıye düzenlemek yaklaşık iki gün sürecektir; büyüme ortamını aspire edin ve 50 ng/mL IL-1β içeren taze ortam ekleyip dört ila altı saat inkübe edin. Hücre tek tabakaları artık akış odası analizi için hazırdır. Ek HBMEC-60 hücre plakaları, IL-1β ile stimüle edilebilir ve 37 °C'de bir saat boyunca 20 µg/mL nötralize edici anti-human e-selectin antikoru ile muamele edilebilir.

Bu, e selektinin fonksiyonel ekspresyonu için kontrol sağlayacaktır. Ardından, e selektin pozitif lökositleri hazırlayın. Bunlar, insan hematopoetik progenitör hücreleri olan KG-1a hücreleridir.

Bunlar, RPMI 1640 içerisinde konfluense ulaşana kadar veya mililitrede 10⁶ hücre yoğunluğuna gelene kadar süspansiyon kültüründe büyütülür. KG-1A hücreleri doğrudan kültürden pipetlenip hemositometre ile sayılabilir. Hücreleri, 10 mM HEP veya 2 mM kalsiyum klorür içeren HH tamponu eklenmiş HBSS içerisinde mililitrede 10⁶ hücre olacak şekilde yeniden süspanse edin.

Hücreleri analiz edilene kadar buz üzerinde saklayın. Sonraki adımlar mikroskobun, paralel plakalı akış odasının ve şırınga pompasının hazırlanmasını içerir. Analiz için mikroskobu ve şırınga pompasını açın.

Mikroskoptan 10x objektifi seçin. Tutucuya 50 mililitrelik konik tüp yerleştirin ve içini iki milimolar kalsiyum klorür içeren HH tamponu ile doldurun. Ardından, alt taraftaki tutucuya beş mililitrelik plastik test tüpleri yerleştirin.

Ardından, şırınga pompasına 60 mL'lik bir şırınga yerleştirin. Hem pistonun hem de şırınga gövdesinin sabitlendiğinden emin olun. 60 mL'lik şırınganın ucuna üç yollu bir musluk ve ardından bu musluğa 5 mL'lik bir şırınga takın.

Paralel akış odası düzeneğini; giriş tüpü sağda, çıkış tüpü solda ve vakum tüpü arkada olacak şekilde mikroskop tablasına yerleştirin. Borular vakuma bağlandıktan sonra, paralel plaka düzeneğinin tablaya yapışmasını sağlamak için hava valfini açın. Bu işlem, akış odasındaki vakum eteğinin hava sızdırmaz olup olmadığını test edecektir.

Sızdırmazlık onaylandığında, hava valfini kapatın. Şimdi çıkış tüp hattını, şırıngaya önceden bağlanmış olan üç yollu musluğa takın. Düzenek, H-B-M-E-C 60 hücrelerinin üzerine yerleştirilmeye hazır hale gelmiştir.

Vakumu açın, akış odası düzeneğini yavaşça plakanın üzerine indirin ve düzeneğin vakumla yapışmasını sağlayın. Hava kaçağına dair herhangi bir ses gelmemelidir; bu aşamada, kauçuk contayı sıkıştırmak için odaya basınç uygulamanız gerekebilir. Vakum kurulduktan sonra, giriş tüpünü 50 mililitre konik tüpün içine yerleştirin.

Üç yollu musluğu 60 mil şırınga konumuna getirin ve plakadaki hücreleri yerinden kaldırmadan hatlardaki havayı tahliye etmek için pompayı pompa moduna alın. Giriş tüpünü doldurmak için dakika başına iki mil olarak ayarlanan şırınga pompasını kullanın. Ardından hızla dakika başına 0,5 mil değerine ayarlayın.

Sıvı düzeneğe ulaşmadan hemen önce, tek tabakayı plakadan kaldırabilecek hava kabarcıklarını önlemek için kurulumun dikkatle hazırlanması kritiktir. Sıvı 60 mil şırıngaya girdiğinde, akış odası ve şırınga pompası hazır hale gelmiş olur. Şimdi, giriş, çıkış ve vakum hatlarının her birinin üzerine bir parça bant yapıştırarak akış odasını sahneye sabitleyin.

Bu, veriler görselleştirilirken ve toplanırken görüş alanının sabit kalmasını sağlar. Akış odası artık kullanıma hazırdır. Bu adımlar, her hücre girişi çalışması ve her yeni plaka için tekrarlanmalıdır.

Lucas bölgesi yuvarlanma olaylarını yakalamak için masaüstündeki NIS elements programını açın ve canlı görüntü için oynat simgesine basın. Otomatik pozlama, plakayı görmenizi ve görüntüyü odaklamanızı sağlayacaktır. Mikroskobun odak ayarını manuel olarak yaparak, hücre monotabakasının düzgün şekilde odaklandığından emin olun.

Görüntü netlendiğinde, pozlamayı saniyede bir kareye sıfırlayın ve mikroskoptaki ışığı ayarlayın. Görüntü bilgisayarda görünmeli ve artık mikroskopta görünmemelidir. Ardından, arka plan pozlamasını gidermek veya hücre netliğini artırmak için ışık histogramı ayarlanabilir; video kaydı için ideal bir görüntü elde etmek amacıyla "two by two bin" veya "live bin" seçeneğine tıklayın.

Menü çubuğundaki macro seçeneğine tıklayın ve sağ taraftan port seçimine giderek com 3 portunu seçip açın. Bu işlem, şırınga pompasıyla koordinasyon sağlamak için portu açar. Akış odası artık KG1-A hücreleri ile infüze edilmeye hazırdır; giriş boru hattının yanındaki 5 ml'lik test tüpüne 1 ml KG1-A hücresi süspansiyonu pipetleyin.

Ardından giriş hattını deney tüpünün tabanına yerleştirin. Menü çubuğuna gidin ve capture (yakalama) ile time lapse acquisition (zaman ayarlı görüntüleme) seçeneklerine tıklayın. 210 saniye süren protokolü seçin.

Bu, H-B-M-E-C 60 hücreleri üzerinde yuvarlanma deneyi için programın uzunluğudur. Her faz, pompa protokolü süresince her saniyede bir fotoğraf çekecek şekilde programlanmıştır. Ayrıca, pompayı başlatmak için comm three portu üzerinden bir komut gönderecek şekilde ayarlanmıştır.

Şırınga pompasını, belirli akış hızlarının manuel olarak programlanmasına olanak tanıyan program moduna ayarlayın. Bu işlem, hazne içindeki kayma gerilimi seviyelerini belirleyecek ve H-B-M-E-C 60 hücreleri üzerindeki KG one A hücre etkileşimlerini düzenleyecektir. Bu etkileşimler için ayarlar, 45 saniye boyunca santimetrekare başına 4,2 dine olarak belirlenmiştir.

Santimetrekare başına 0,3 dyne değeri 60 saniye boyunca uygulanır ve ardından her 15 saniyede bir, maksimum santimetrekare başına 4,2 dyne değerine kadar kademeli olarak artırılır. Mikroskop ve bilgisayar artık zaman ayarlı fotoğraf çekimi yapmaya hazırdır. Programı çalıştırırken veri toplamaya başlamak için bilgisayar üzerinden başlat düğmesine basın.

Giriş çıkış borularının besiyeri ile dolu kalmasını sağlamak ve sisteme hava kabarcıklarının girmesini önlemek için KG one A hücrelerini içeren tüpe besiyeri eklediğinizden emin olun. Zaman ayarlı çekim (time lapse) kesintiye uğrarsa, pompa kendiliğinden durmaz ve sıfırlanması gerekir. Canlı görüntüye dönmek için iptal seçeneğine basın.

Uyarılmamış bir endotel hücre monokatmanı, bu deney için negatif kontrol olarak kullanılır. Bunu gerçekleştirmek için, E-selektin bağımsızlığını kontrol etmek amacıyla, işlem görmemiş H-B-M-E-C 60 hücrelerinin üzerindeki akış odasına KG-1A lökositleri infüze edin; ardından etkiden bağımsızlığı daha fazla kontrol etmek için endotel hücre monokatmanını IL-1β ile uyarın ve lökositleri bu hücrelerin üzerine infüze edin. H-B-M-E-C 60 hücrelerini önce IL-1β ile, ardından anti-insan S-selektin antikoru ile tedavi edin.

Ardından, bu hücreler üzerindeki lökosit yuvarlanma olaylarını analiz edin. Hücre yuvarlanması sadece S selektin tarafından değil, aynı zamanda lökosit hücre yüzeyindeki sialik asit kalıntıları tarafından da belirlenir. Bunu göstermek için, KG one A hücrelerini 37 °C'de bir saat boyunca 0,1 units/ml nöraminidaz ile sindirin.

Ardından, stimüle edilmiş H-B-M-E-C 60 hücreleri üzerindeki yuvarlanma olaylarını analiz edin. Lökosit yüzeyindeki glikoproteinler de hücre yuvarlanması için önemlidir. Bu durum, KG one A hücrelerinin 37 °C'de bir saat boyunca mil başına 0,2 ünite bromelan ile işlenmesi ve ardından akış odasına infüze edilmesiyle gösterilebilir.

Zaman serisi elde edildikten sonra, veriler analiz için hazır hale gelir. Verileri kaydedin, menü çubuğundaki measure sekmesine gidin ve defined threshold seçeneğini seçin. İstenilen hücreler kırmızıya boyanana kadar çubukları kaydırın, tüm görüntüleri seçin ve ardından okay düğmesine tıklayın; artık tüm zaman atlamalı dizi, görünür kırmızı yuvarlanan hücrelerle modifiye edilmiş olmalıdır.

Ölçüm (measure) kısmına gidin ve kısıtlamaları (restrictions) seçin. Bu, kullanıcının yuvarlanan hücreleri temsil etmeyen eşik nesnelerini hariç tutmasını sağlar. Bunlar temel olarak H-B-M-E-C 60 monokatmanı tarafından oluşturulan arka plandır; seçili alan için yuvarlanan lökositler için ideal olan minimum ve maksimum değerleri girin.

Bu adımı uzama ve dairesellik için tekrarlayın. Ölçüm seçeneğini belirleyin ve ardından kısıtlamaları kullanarak ikili oluştur seçeneğini belirleyin. Önceki adımda ayarlanan aynı kısıtlama değerleri, şimdi endotelyal hücre monokatmanındaki yuvarlanan lökositleri tanımak için NIS elements yazılımını optimize etmek amacıyla kullanılacaktır. Ölçüm kısmına geri dönün, alan verilerini seçin ve ardından verileri sıfırla seçeneğini belirleyin.

Menüyü kapatın, ölçüme geri dönün ve tarama alanını seçin, ölçüm alanı verilerini açın ve nesne sayısını seçin. Ardından tüm alanları seçin ve verileri Microsoft Excel'e aktarın. Son olarak, verileri temizle seçeneğini belirleyin.

NIS elementleri artık daha fazla veri toplama için hazırdır. Bu temsili veriler, lökosit endotel hücre etkileşimlerinin fizyolojik kayma stresine nasıl tepki verdiğini, özellikle adeziv ligand E selektinin rolünü test ederek göstermektedir.

Endotel hücreleri IL-1β ile önceden stimüle edildiğinde güçlü lökosit yuvarlanması gerçekleşir. Bu sonucun stimüle edilmemiş kontrol grubu ile karşılaştırılması, hücre yuvarlanmasının sitokin stimülasyonuna bağlı olduğunu açıkça göstermektedir. HBMEC-60 hücrelerinin IL-1β ve ardından anti-insan E-selektin antikoru ile işlenmesi, hücre yuvarlanmasının spesifik olarak E-selektine bağlı olduğunu ortaya koymaktadır.

Bu analiz, diğer parametreleri test etmek için de kullanılabilir. Örneğin, stimüle edilmiş hücreler bir sase veya brolin ile ön işlemden geçirildiğinde, sonuçlar daha az belirgin hale gelmektedir. Bu veriler, terminal sialik asit kalıntılarının yanı sıra hücre yüzey glikoproteinlerinin önemini vurgulamaktadır.

S selektin ligand aktivitesi için; lökositler ile endotel hücreleri arasındaki E selektin tabanlı adeziv etkileşimlerin, lökositlerin kandan ayrılıp dokulara girdiği dolaşım sistemi bölgesi olan postkapiller venül ile benzer kuvvet koşulları altında nasıl analiz edileceğini gösterdik. Bu prosedürü uygularken, ilgili selektinin ve ligandının bu analiz sistemindeki gerekliliğini doğrulamak için uygun bloklama antikoru veya enzimatik işlem kontrolünün kullanılmasını hatırlatmak önemlidir. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.