Asimetrik Reseptör Desenler Hücre Rolling Yörüngeler incelenmesi
13 Şubat 2011
Biz asimetrik reseptör-desenli yüzeyler üzerinde hücre haddeleme yörüngelerini gözlemlemek ve analiz etmek için bir protokol açıklar. Ortaya çıkan veriler etiket ücretsiz cep ayırma ve analiz için reseptör-desenli yüzeylerin mühendisliği için yararlıdır.
Bu protokol, etiketsiz hücre ayırımı ve analizi için reseptör desenli altlıkların mühendisliğini kolaylaştırmak amacıyla, asimetrik reseptör desenleri üzerindeki hücre yuvarlanma yörüngelerini gözlemler ve analiz eder; işlem, altın bir altlık üzerine PEG moleküllerinin mikro temas baskısı ile uygulanarak ardışık kendiliğinden düzenlenen tek tabakalı desenlerin oluşturulmasıyla başlar ve ardından altlığın P selectin reseptörleri ile doldurulmasıyla devam eder. Ardından, altlık akış odasına yerleştirilir. HL 60 hücreleri odanın içine akıtılır.
HL 60 hücrelerinin P selectin desenleri üzerindeki yuvarlanma etkileşiminin bir görüntü dizisini kaydedin ve videodan dönüştürülen görüntüleri analiz edin. Yuvarlanan hücre kenar izleme uzunluğu ile düzlem, bölge ve kenardaki yuvarlanma hızlarının yörüngeleri bir MATLAB programı kullanılarak elde edilebilir. Bu yöntem, HO 60 hücrelerinin kayma akışında asimetrik reseptör desenleri üzerinde nasıl hareket ettiğine dair bilgi sağlayabilir.
Bu yöntem, diğer hücre yüzey etkileşimlerinin nicelleştirilmesi, reseptör desenleri üzerindeki yörüngelerinin gözlemlenmesi yoluyla hücrelerin doğrudan analizi ve hücre ayırma için mikro ayak basma cihazlarının tasarımı için uygulanabilir. Altın substrat üzerinde PEG moleküllerinden oluşan kendi kendine düzenlenen tek tabakaların ardışık desenlerini oluşturmak için mikro temas baskılama kullanılır.
İlk olarak PDMS damgayı etanol içindeki beş millimolar PEG çözeltisi ile mürekkepleyin. Yüzeyi 20 dakika boyunca kurutun. Damgayı altın yüzeyin üzerine 40 saniye boyunca nazikçe yerleştirin ve altın yüzey ile damga arasında iyi bir temas olduğundan emin olun.
Fazladan basınca gerek yoktur. Yüzeyi etanol ile durulayın ve bir nitrojen akımı altında kurutun. Şimdi bir perfüzyon odası kullanarak, kalan alanları P selectin ile desenlemek için substratları 15 µg/mL P selectin çözeltisi ile oda sıcaklığında üç saat boyunca inkübe edin, odayı durulayın ve ardından spesifik olmayan etkileşimleri engellemek için yüzeyleri 1 mg/mL BSA ile bir saat boyunca geri doldurun.
Hücre yuvarlanma deneyini gerçekleştirmeden önce yüzeyi DPBS tamponu ile durulayın. Akış hücresini monte edin ve ardından, reseptör deseninin eğim açısı 10 derece olan dikdörtgen bir akış hücresi içindeki desenli yüzeyler üzerinden mililitrede 10⁵ HL 60 hücresi içeren bir süspansiyon akıtın.
24.5 °C oda sıcaklığında. Şırınga pompasını, santimetre kare başına 0.5 dyne karşılık gelen laminar kayma gerilmesiyle, dakikada 75 µL akış hızı oluşturacak şekilde ayarlayın. Şimdi, ters mikroskop ve monte edilmiş bir kamera ile HL 60 yuvarlanmasını kaydedin.
Yapışkan p-selektin ve substratlar ile etkileşimler. Saniyede bir kare hızında, 4x objektif kullanarak 300 saniye boyunca görüntüleme yapın. Üç bağımsız deney gerçekleştirin.
Verileri, her deneyden elde edilen ortalama değerlerin ortalaması ve standart sapması olarak sunun. Mikroskop görüntüleri, HL 60.Rolling videosundan dönüştürülmüştür. Adeziv p-selektin ve substratlar ile etkileşimler, sırasıyla p-selektin reseptörü ve PEG bölgelerine karşılık gelen parlak ve karanlık bölgeleri göstermektedir.
İzler, burada özelleştirilmiş bir MATLAB programı kullanılarak belirlenmiştir. Kenar eğim açısı 10 derece ve kayma gerilmesi santimetrekare başına 0.5 dine olarak belirlenmiştir. Kenar izleme uzunluğu dağılımı, kenar izleme uzunluğunun ortalama değerinin yanı sıra bantların kenarındaki ve içindeki yuvarlanma hızları olan VE ve VP üzerine daha ileri analizler yapılmıştır.
Bu videoyu izledikten sonra, asimetrik reseptör paternleri üzerindeki hücre yörüngelerinin nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, etiketsiz hücre ayırma ve analizi için reseptör desenli altlıkların mühendisliğini kolaylaştırmak amacıyla, asimetrik reseptör desenleri üzerindeki hücre yuvarlanma yörüngelerini gözlemler ve analiz eder.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre biyolojisi
- Biyomalzemeler
- Mikroakışkanlar
Arka Plan
- Hücre yuvarlanması, çeşitli biyolojik etkileşimlerde kritik bir süreçtir.
- Asimetrik reseptör paternleri hücre davranışını etkileyebilir.
- İşaretsiz teknikler, hücre ayrıştırma ve analizi için gereklidir.
- Mikro temas baskılama, paternlenmiş alt tabakalar oluşturmak için yararlı bir yöntemdir.
Çalışmanın Amacı
- Reseptör desenli alt katmanlar üzerinde hücre yuvarlanmasını gözlemlemek için bir protokol geliştirmek.
- Daha iyi alt katman mühendisliği için yuvarlanan hücrelerin yörüngelerini analiz etmek.
- Akış koşulları altında hücre hareket dinamikleri hakkında bilgi sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Altın bir substrat üzerine PEG moleküllerinin mikro temas baskılama yöntemiyle aktarılması.
- Ardışık öz-düzenleyici tek tabakalı örüntülerin oluşturulması.
- Substratın P-selectin ve reseptörler ile doldurulması.
- Akış odasına yerleştirme ve örüntüler üzerinde yuvarlanan HL-60 hücrelerinin görüntülenmesi.
Temel Sonuçlar
- HL-60 hücre etkileşimlerinin görüntü dizileri kaydedildi.
- Yuvarlanan hücrelerin yörüngeleri MATLAB kullanılarak analiz edildi.
- Kenar takip uzunluğu ve yuvarlanma hızlarına ilişkin veriler elde edildi.
- Asimetrik reseptör desenleri üzerindeki hücre hareketine dair bilgiler sağlandı.
Sonuçlar
- Protokol, hücre yuvarlanma dinamiklerinin ayrıntılı analizini sağlar.
- Etkili hücre ayırımı için asimetrik reseptör desenleri tasarlanabilir.
- Bu yöntem, hücrelerin kayma akışındaki davranışlarının anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Asimetrik reseptör desenleri üzerindeki hücre yuvarlanma yörüngelerinin anlaşılması, etiketsiz mikroakışkan ayırma cihazlarının rasyonel tasarımına olanak tanır. Bu protokol, belirlenmiş kayma gerilimi altında kenar takip uzunluğu ve yuvarlanma hızı hakkında nicel veriler sağlayarak, hücrelerin akış içindeki davranışlarının öngörülü modellenmesini destekler. Bu tür içgörüler, hücre saflaştırma ve fenotipik analiz iş akışları için cihaz mühendisliğindeki ampirik tekrarları azaltır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Fizyolojik kayma altında ligand-reseptör bağlanma kinetiğinin incelenmesine olanak tanıyarak, adezyon aracılı yollar için hedef doğrulama sürecine bilgi sağlar.
- Operasyonel Değer: Floresan etiketler veya genetik raporlayıcılar olmadan, fonksiyonel reseptör aktivitesini değerlendirmek için etiketsiz bir yöntem sunar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Reseptör yoğunlukları veya desen geometrileri genelinde karşılaştırmalı analizler için hücre yuvarlanma hızı ve kenar takip uzunluğuna dair nicel veriler üretir.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilir adezyon deneyleri için mikrotemas baskılama ve akış odası entegrasyonu aracılığıyla substrat hazırlığını standartlaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Reseptör desen tasarımını gözlemlenebilir hücre yörüngesi sonuçlarıyla ilişkilendirerek, adezyon tabanlı ayırma stratejilerinin mekanistik risklerinin azaltılmasını destekler.
- Operasyonel Değer: Yuvarlanma davranışına dayalı hücre fenotiplerinin taranmasına olanak tanır; bu özellik, preklinik modellerdeki alt popülasyonların zenginleştirilmesi için faydalıdır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, özellikle akış altında adhezyonun fonksiyonel bir okuma olduğu hedefler için, assay geliştirme ve preklinik araç oluşturmaya bilgi sağlamak amacıyla erken keşif aşamasına uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Kayma akışındaki reseptör-ligand etkileşimlerinin hipotez testlerini kolaylaştırarak hücre yuvarlanmasına yönelik mekanistik katkıları netleştirir.
- Tarama: Hücre hatlarının veya reseptör modülatörlerinin karşılaştırılmasına olanak tanıyan standartlaştırılmış, kantitatif adezyon metrikleri sunar.
- Analitikler: Kenar izleme uzunluğu ve yuvarlanma hızı dağılımlarını çıktı olarak vererek koşul karşılaştırmaları için istatistiksel temel sağlar.
- Translasyonel Araştırma: In vitro yuvarlanma dinamiklerini, preklinik örnek işleme için etiketsiz hücre ayırma cihazlarındaki potansiyel fayda ile ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla hedef ve hücre tipi genelinde adezyon aracılı hücre davranışını değerlendirmek için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kontrollü kayma altında yörünge parametrelerini nicelleştirerek, adezyon tabanlı ayırma mekanizmalarındaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standardize edilmiş mikrotemas basımı, reseptör geri doldurma ve akış odası kurulumu aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Reseptör desenlerinin erken aşama fonksiyonel doğrulamasını sağlayarak, cihaz geliştirmedeki geç aşama biyolojik risklerini azaltır.
- Portföy Etkisi: Desen performansı hakkında ampirik veriler sağlayarak, mikroakışkan ayırma teknolojileri için git/gitme (go/no-go) kararlarını destekler.
Uygulama Hususları
- Mikrotemas baskılama, yüzey kimyası ve mikroakışkan akış kontrolü konularında uzmanlık gerektirir.
- Ters aydınlık alan mikroskobuna, yüksek hızlı kameraya ve MATLAB tabanlı partikül takip araçlarına erişime bağımlıdır.
- Çok merkezli tekrarlanabilirlik için alt tabaka üretimi ve akış koşulları raporlamasının ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Alternatif hücre tiplerine adaptasyon, ligand-reseptör çiftlerinin doğrulanmasını ve kayma gerilmesi parametrelerinin optimizasyonunu gerektirir.
- Hücre-kenar etkileşimlerinin geçici doğasıyla sınırlıdır; bu durum tam yörünge rekonstrüksiyonunu kısıtlar ve segmentli analiz yapılmasını zorunlu kılar.
