Çevre transkriptomik kullanarak Deniz Mikrobiyal Toplulukları Gen İfade Analizi

Bu prosedür, denizel mikrobiyal biyokütlenin su örneklerinden beş ve üç mikrometrelik filtrelerle ön filtrasyon yapılması ve ardından 0,22 mikrometrelik bir filtre üzerine toplanmasıyla başlar. Daha sonra, 0,22 mikrometrelik filtrede tutulan organizmalardan toplam RNA ekstre edilir. Toplam RNA'dan, seçici enzimatik yıkım ve subtraktif hibridizasyon yoluyla OUR RNA'sı uzaklaştırılır ve zenginleştirilmiş Mr.N, polyA kuyruklama ve in vitro transkripsiyon aracılığıyla lineer olarak amplifiye edilir.

Amplifiye edilen antisense RNA, ardından rastgele hekzameler kullanılarak çift zincirli cDNA'ya dönüştürülür. Elde edilen cDNA klonlanıp dizilenebilir veya doğrudan pirosekvanzlanabilir. Merhaba, ben University of Georgia Deniz Bilimleri Bölümü'nden Dr. Marianne Moran'ın laboratuvarından Rachel Persky.

Bugün size çevresel örneklerdeki gen ifadesinin incelenmesine yönelik bir prosedür göstereceğiz. Çevresel metatranskriptomik yöntemini kullanarak, Scott Gifford çevresel örneklerin RNA toplama işlemi için nasıl hazırlanacağını size gösterecek.

Örneklerden RNA ekstraksiyonunu ve Johanna RIN değerlerini nasıl belirleyeceğinizi göstereceğim. AON, RNA uzaklaştırma işlemini uygulamalı olarak gösterecek. Ardından Maria Kosta, RNA amplifikasyonu ve cDNA sentezi adımlarını detaylandıracaktır.

Öyleyse başlayalım. Çevresel RNA toplama işlemine başlamak için, boru hattının bir ucunu örnekleme yapılacak istenen derinlikteki suya yerleştirerek ve diğer ucunu yüksek hacimli 3 µm'lik bir filtreye bağlayarak filtre hattı sistemini kuruyoruz; pompayı ise boru hattının iki ucu arasına yerleştiriyoruz. Daha sonra 3 µm'lik filtre, 0.22 µm'lik filtre kulesine bağlanır ve çıkış akışı 0.22 µm'lik kuleden dereceli bir kaba yönlendirilir.

Sistemi durulamak için birkaç litre su geçirin. İşlem tamamlandığında, hattaki kalan suyu tahliye etmek için pompa çalışırken tüpleri sudan çıkarın. Ardından, bir pens yardımıyla filtre kulesine 0,22 mikrometre filtre yerleştirin ve kuleyi kapatın.

Hattın ucunu tekrar suya yerleştirin ve pompayı çalıştırın. Havanın her iki filtreden de tahliye edilmesine izin verin ve carboy üzerindeki suyla filtrelenen hacmi izleyin. İstenen hacim filtrelendiğinde, hattı sudan çıkarın ve sistemde kalan suyu tahliye edin.

Filtre kurur kurumaz, üst filtre plakasını hızla çıkarın ve filtre kağıdını katlayın. Filtreyi bir whirl pack içerisine yerleştirin ve sıvı azot ile şok dondurun. Deneye başlamadan önce, RNA'ların her yerde bulunduğunu ve mRNA'ların hızla degrade olduğunu göz önünde bulundurarak; çalışma yüzeyleri ve pipetler dahil olmak üzere, ribonükleaz içermeyen bir ortamda çalışma standart önlemlerinin takip edilmesi gerektiğini belirtmek önemlidir.

Bu husus göz önünde bulundurularak, bu prosedürde kullanılan tüm materyallerle çalışırken temiz eldiven giyilmelidir. Ayrıca örnekler mümkün olan en kısa sürede işlenmelidir. 0.22 mikrometre filtreden toplam RNA ekstraksiyonuna başlamak için, 50 mililitrelik konik bir tüpe beta meto ethanol eklenmiş sekiz mililitre RLT tamponu ekleyerek boncuklu tüpleri hazırlarız.

Ardından, bir mobil güç toprak ekstraksiyon kitinden bir ila iki mililitre RNA boncuğu eklenir. Donmuş filtre dondurucudan hızla çıkarılır ve paket içinde tutularak bir tokmakla parçalanır.

Parçalanmış filtreyi hazırlanmış 50 mililitrelik konik tüpe ekleyin ve tüp kapağını parafilm veya laboratuvar bandı ile kapatıp 10 dakika boyunca vorteksleyin. Ardından 50 mililitrelik tübü 5.000 RPM'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, lizatın mümkün olduğu kadar çoğunu uzaklaştırın ve beş dakika daha santrifüjlemeden önce 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.

5.000 ×g'de santrifüjleme sonrası, süpernatan yeni bir 50 mililitre tüpe aktarılır ve lizata bir hacim %100 ethanol eklenir. 10 mililitrelelik bir şırınga kullanarak, lizatı 18 ila 21 gauge bir iğne aracılığıyla çekin ve yaklaşık beş kez geri boşaltın. Sonraki ekstraksiyon adımlarında, üretici talimatlarını izleyerek KaiGen R and easy mini kit kullanın ve lizatı, vakum manifoldu veya tekrarlayan santrifüjleme yoluyla sağlanan kolona uygulayın.

Toplam RNA miktarını spektrofotometrik olarak belirleyin. Toplam RNA verimi belirlendikten sonra, herhangi bir DNA kontaminasyonunu gidermek için Ambien turbo DNA free kit'i üretici talimatlarına göre kullanıyoruz. RNA ekstraksiyonları tamamlandığına göre, birinci ve ikinci rRNA giderme adımlarını gerçekleştirecek olan Johanna'ya toplam RNA'yı teslim edeceğim.

Teşekkürler Rachel. rRNA uzaklaştırma işlemine başlamak için, kullanmadan önce 10 kat konsantrasyonlu reaksiyon tamponunu steril, RNA içermeyen 0,5 mililitrelik bir tüp içinde nazikçe karıştırın ve kısa süreliğine santrifüjleyin; ardından 10 kat konsantrasyonlu reaksiyon tamponu, RNA inhibitörü, toplam RNA örneği ve terminator eksonükleazın uygun hacimlerini birleştirin. Epicentre protokolüne uygun olarak, reaksiyonu ısıtmalı kapağı olan bir termosiklette veya su banyosunda 30 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, öncelikle toplam hacim 200 µL olacak şekilde RNase free water ekleyip, ardından mRNA santrifüj tüpüne bir hacim oranında bire bir fenol kloroform çözeltisi ekleyerek reaksiyonu fenol etanol çöktürme ile sonlandırın. Sulu fazı toplayın ve ardından yüzde yüz etanol ve tuz ile çöktürün. Burası potansiyel bir duraklama noktasıdır.

RNA, numuneyi sonraki uygulamalarda kullanmaya hazır olana kadar -80 °C'de saklanabilir. İlk mRNA zenginleştirmesini tamamladığımızda, numunemizdeki kalıntı rRNA'ları uzaklaştırmak için üretici talimatlarına uygun olarak Ambien microbe enrich ve microbe express kitlerini kullanacağız. Ökaryotik rRNA'ların uzaklaştırılmasını kolaylaştırmak için microbe enrich kitini kullanacağız.

Tüm hacimler üretici talimatları okunarak belirlenir. Başlamak için, 1,5 mililitrelik bir tüpe 300 mikrolitre bağlanma tamponu pipetleyin. Maksimum 30 mikrolitre hacminde toplam beş ila 100 mikrogram RNA ekleyin ve vorteksleyin.

Bağlama tamponuna beş mikrogram RNA için iki mikrolitre yakalama oligo karışımını nazikçe ekleyin ve tüpü hafifçe tıklatın. Karışımı kısa süreliğine santrifüjle çöktürün. Karışımı 37 °C'de bir saat boyunca bekletmeden önce, 70 °C'de 10 dakika boyunca denatüre edin.

Bu inkübasyon sırasında, oligo manyetik boncuklarını bir kez nükleaz içermeyen suda ve bir kez bağlama tamponunda yıkayarak ve yıkamalar arasında boncukları manyetik bir standa tutturarak hazırlayın. Boncukları buz üzerinde saklayın ve oda sıcaklığına kadar ısıtın. Kullanımdan beş dakika önce yıkama çözeltisini bir ısıtma bloğunda 37 °C'ye ısıtın.

Yıkanmış oligo manyetik boncuklara RNA yakalama oligo karışımını ekleyin, tüpü nazikçe karıştırın ve santrifüjleyin. Karışımı 37 °C'de 15 dakika boyunca kısa süreli olarak inkübe edin. Tüpü manyetik standa yerleştirin ve mRNA içeren süpernatantı aspire edip buz üzerindeki bir toplama tüpüne aktarmadan önce yaklaşık üç dakika bekleyin.

Ardından, yakalanmış boncuklara 100 µL ön ısıtılmış yıkama çözeltisi ekleyin. Yakalama boncuklarını nazikçe vorteksleyin ve süpernatantı geri kazanın. mRNA içeren bu süpernatantı buz üzerindeki toplama tüpüne aktarın.

Ambi microbe express kit kullanarak prokaryotik RRNA'yı uzaklaştırmaya hazırlanırken, kalıntı prokaryotik RRNA'yı temizlemek için kullanacağımız bir toplama tüpünü buz üzerine yerleştirin. RRNA kontaminasyonunu ve mRNA kalitesini kontrol etmek için bioanalyzer veya Experion kullanın. Burası potansiyel bir durma noktasıdır.

RNA, negatif 80 derece Celsius'te saklanabilir. RRNA uzaklaştırıldıktan sonra, mRNA'yı amplifiye etmek için üretici talimatlarına uygun olarak Ambien message AMP two bacteria kitini kullanacağız. Artık saf bir mRNA örneğine sahip olduğumuza göre, deneyi mRNA amplifikasyonu ve CDNA sentezi süreçlerinde size rehberlik edecek olan Maria'ya devrediyorum.

Teşekkürler, Hannah. mRNA amplifikasyonuna başlamadan önce, Ambien message AMP two bacteria kit master mix bileşenlerinin hacimlerini hesaplayalım; ardından, 1000 nanograma kadar toplam RNA'yı steril, RNA içermeyen bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirerek kalıp RNA'nın poliadenilasyonuna başlıyoruz. İn vitro transkripsiyon yoluyla RNA sentezlemek için ilk tamponda 6,5 mikrolitre numune ve RNA içermeyen su kullanın.

Homojen sıcaklık sağlamaları nedeniyle hibridizasyon fırını veya inkübatör kullanımı önerilir. Tüplerin içinde yoğuşma oluşmaması son derece önemli olduğundan, 14 saatlik bir in vitro transkripsiyon reaksiyonu inkübasyonu şiddetle tavsiye edilir. En yüksek RNA verimini maksimize etmek için IBT'yi 40 µL final reaksiyon hacminde gerçekleştirin ve RNA'yı yaklaşık 10 µL'lik miktarlarda -80 °C'de saklayın.

RNA amplifiye edildikten sonra, komplementer DNA veya cDNA sentezleme zamanı gelmiştir. RNA'dan cDNA sentezlemek için Promega universal ribot Clone cDNA sentez sistemi kiti kullanılır. Kit, iki mikrogram RNA'nın cDNA'ya dönüştürülmesi için talimatlar sağlar. Biz, altı ila 10 mikrogram RNA girişi yapmanızı ve reaksiyonları buna göre ölçeklendirmenizi öneririz.

CD NA'yı, etanol çöktürme yöntemi veya Promega Wizard DNA temizleme sistemi kullanılarak temizleyin. Üretici talimatlarına uygun olarak numuneleri -80 °C'de saklayın; çift zincirli cDNA bu aşamadan itibaren doğrudan dizilenebilir. 10 L deniz suyundan yaklaşık 10 µg çevresel RNA ekstre ettik ve 20 kat amplifiye ettik; amplifiye edilmiş mRNA'nın çift zincirli cDNA'ya dönüştürülmesiyle çevresel transkriptlerin dizilenmesi ve analizi için yeterli miktarda materyal elde edildi. Denizel mikrobiyal topluluklardan çevresel meta-transkriptomik kullanarak gen ekspresyonunun nasıl değerlendirildiğini göstermiş olduk.

Bu prosedürü gerçekleştirirken, mRNA'nın hızla degrade olduğunu ve RNA'ların her yerde bulunduğunu her zaman hatırlayın. Bu nedenle, ribonükleazdan arındırılmış bir ortamda çalışmak için standart önlemleri alın ve numuneleri mümkün olduğunca hızlı bir şekilde işleyin. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.