Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarray'ler Kullanımı

Merhaba, benim adım Ena ve laboratuvarımızda rutin olarak gen ekspresyon profillemesi yapıyoruz. Bu tekniği, met ve wild type arasındaki diferansiyel regüle edilen genleri izlemek için kullanıyoruz. Bugün elimde wild type ve met RNA örnekleri var ve önce hepsine cDNA sentezi yapacağız.

İndirekt etiketleme yöntemlerini kullanıyoruz ve bu tekniğin avantajı, direkt etiketlemede meydana gelebilecek göz yanılmasını önlemektir. Bunu gerçekleştirmek için RNA örneklerimiz mevcuttur ve toplam 13 µL hacimde 3 µg RNA elde etmeyi tercih ediyoruz. Ayrıca, karışımlarımıza 2,5 µg random hexamer ekliyoruz.

RNA'nın doğasını korumak için örneği sekiz dakika boyunca 75 °C'de inkübe edeceğiz. Şimdi ise; AM L-D-L-D-U-T-P kontinu karışımı, ters transkriptaz tamponu ve ayrıca ET TT içeren ters transkripsiyon kokteylini ekleyip numuneyi vorteksleyeceğiz. Ardından örneği dört saat boyunca 42 °C'de inkübe edeceğiz. Dört saatin sonunda örnekleri dışarı çıkaracağız.

Şu an tüpte cDNA ve RNA karışımına sahibiz. Yapmak istediğimiz şey, sodyum hidroksit ve EDTA ekleyerek RNA'yı hidroksilleyerek parçalamaktır; sodyum hidroksit için son konsantrasyon 100 mM, EBt için ise son konsantrasyon 5 mM olmalıdır.

Şimdi örnekleri 10 dakika boyunca 65 °C su banyosunda inkübe edeceğiz. İnkübasyon işlemi tamamlandı ve örnekleri, final konsantrasyonu 500 molar olacak şekilde pH 7 HEPES tamponu ekleyerek kullanacağız. Bu aşamada örnekleri -20 °C'de saklayabilir veya temizleme işlemine devam edebilirsiniz.

cDNA temizliği için KaiGen PCR saflaştırma kiti kullanıyoruz. Ancak, Bush tamponu ve iyon tamponu ferritin içerdiğinden, kendi fosfatlı Bush tamponumuzu ve fosfatlı iyon tamponumuzu hazırlıyoruz; 300 µL PPI ekleyip bunu yavaşça pipetleyoruz, ardından karışımı kolonlara aktarıyoruz. En yüksek hızda bir dakika boyunca santrifüj ediyoruz ve ardından hazırladığımız fosfatlı yıkama tamponundan 750 µL ekliyoruz ve aynı işlemi bir kez daha tekrarlıyoruz.

Tüm hücrelerin çöktüğünden emin olmak için örnekleri tekrar santrifüjleyeceğiz. Ardından bu tüpleri boş eppendorf tüplerine aktaracağız. Bunlara, pH 8.5'te 4 molar potasyum fosfat içeren 30 µL fosfat E tamponu ekleyeceğim.

Burada sadece her şeyi kolonun merkezine eklediğinizden emin olmanız gerekir ve oda sıcaklığında bir dakika boyunca inkübe edeceksiniz. Böylece cihaz bir dakika daha dönecektir ve ben 30 µL daha buffer ekleyeceğim; oda sıcaklığında inkübe ediyorum. Ardından kolonu çıkarıyorum ve toplam 60 µL CDA hacmine sahip oluyoruz.

cDNA'yı temizledikten sonra, -20 °C'de saklayabilirsiniz; ayrıca kurutup öyle de saklayabiliriz, yani cDNA'yı vakumla kurutabiliriz. Şu anda tüpte, modifiye edilmiş kuru cDNA bulunuyor. Şimdi yapacağım işlem, kuru örneği süspansiyona almaktır.

Numuneyi pH 9'da 15 mM bikarbonat içeren 10 µL çözeltide süspansiyon haline getireceğim. Bunu, bu aşamada sadece pipetleme yaparak gerçekleştireceğim; cDNA'yı iyice resüspand etmek çok önemlidir. Bağlama reaksiyonunun çalışması için, floresan etiketler ışığa duyarlı olduğundan bu reaksiyon karanlık odada gerçekleştirilmelidir.

Ancak, bunlar yaşam bilimlerinden seçildiği için ayrı paketlerde geldiler. S5 mor kapaklı, S3 ise turuncu kapaklıdır; ayrıca S5 süspanse edildiğinde siyan, Cary ise macenta renginde görünür. Bu nedenle, karanlık odada yapacağım işlem, bu örnekleri boya tüplerine aktarmak, boyayı yeniden süspanse etmek ve ardından örnekleri kendi tüplerine geri aktarmaktır.

Ardından iki saat boyunca karanlıkta inkübe edeceğim; iki saatlik inkübasyonun ardından, pH 5,2'de 100 millimolar sodyum asetatın 35 µL'sini ekleyerek reaksiyonu durduruyorum. Bundan sonra, benzer bir temizleme prosedürü ile temizleme işlemini gerçekleştiriyoruz. Ancak bu kez, kit ile birlikte sağlanan yıkama tamponu ve elüsyon tamponunu kullanıyoruz.

Numuneyi yerleştirdiğiniz yerleri tanımlayabilir ve ardından cihazı temizlemelisiniz. Şu an numunenizi veya karışımınızı ekleyebilirsiniz. Bu, scifi etiketli numunem ve burada gördüğümüz, CDA içeriğini gösteren OD 260 ile scifi için D inklüzasyonunu gösteren OD 650 değerleridir. Burada ise side 3 etiketli numunem yer alıyor.

Tekrar, altı konsantrasyonu ve beş 50 ölçümünü üç numaralı bölgeye dahil ederek döndürün. D korporasyonum verimli çalıştığından, örnekleri şimdi birleştireceğim; ardından bunları kısaca karıştırın. Ve şimdi, geri bildirimi kullanarak yeniden bir örnek hazırlayacağız.

Tamam, lamın hazırlanması için, lamı suyun üzerine yerleştirerek yeniden hidrasyon sağlayacağız ve bu işlem lekelerin büyümesini sağlayacaktır. Ardından bunu korumak için 100 °C'de hızlıca kurutacağız ve daha sonra lekeleri lama UV hibridizasyonu veya UV çapraz bağlama yöntemiyle sabitleyeceğiz ve ardından elimizdeki ön hibridizasyon tamponunda inkübe edeceğiz. Şimdi lamı yüzü aşağıya bakacak şekilde yerleştiriyorum, ancak henüz suya temas etmiyor.

Ve bu şekilde beş dakika bekleyeceğiz. Bu kutu daha büyük görünüyor, eklediğinizden önce olduğundan daha parlak görünmeliler ve lamı 100 derecede tutarak hızlıca kurutacak ve yoğuşmayı gözlemleyeceksiniz. Ve ardından youi ile çapraz bağlama yapacağız.

Hidrasyon için, lamı önceden ısıtılmış suya daldıracağım. Bu işlem oldukça hızlı olmalıdır çünkü buradaki amaç, bağlanmamış olan tüm lekelerden veya lekeler üzerindeki tüm oligolardan kurtulmaktır. Bu işlemde yavaş davranırsanız, lekelerinizde kuyruklanmalar oluşacaktır.

Bu işlemi gerçekten hızlı yaptığınızdan ve lamı sudan çıkarmadığınızdan emin olun. Bu işlemi 30 saniye boyunca gerçekleştirin ve ardından hemen oda sıcaklığında beş dakika boyunca 700 rpm'de santrifüjleyin. Şimdi bu lamı, önceden hazırladığımız tampon çözeltisi içeren kaba yerleştirelim. Lamı yavaşça kavanoza itiyoruz ve burada 42 °C'de en az 45 dakika boyunca inkübe edeceğiz. Buradale hibritlecek olan kurutulmuş örneğimiz mevcut. Önce bunu su içerisinde yeniden süspande edeceğiz.

Bu adımda, pipetle yukarı-aşağı hareketler yaparak sadece resüspansiyon işlemini gerçekleştirin ve numuneyi çok fazla ışığa maruz bırakmayın. Ardından, 10 mg/mL konsantrasyonda 1,5 µL sperm DNA'sı ekleyin. Son olarak 1,2 µM tRNA ekleyin.

Konsantrasyon 12,5 mg/mL'dir, spesifik olmayan hibridizasyonu engellemek için tRNA ve som sperm DNA'sı ekleriz. Ardından, nihai konsantrasyonu 3x yapacak şekilde 5,35 µL 30x SSC ekleriz. Son olarak 3,5 µL %1 SDS ekleriz.

Şimdi karışımı beş dakika boyunca kaynatacağız ve ardından beş dakika boyunca en yüksek hızda santrifüj edeceğiz; böylece işlem tamamlanmış olacak. Slaytımızı inkübe edeli bir saat oldu ve şu an elimde su ve izopropanol var. Bu nedenle, önce SDS'den kurtulmak için slaytı suda çalkalayacağım, ardından izopropanol ile yıkayıp doğrudan standart gauge içine yerleştireceğim.

Burada, kurumayı önlemek için lamın havayla çok fazla temas etmemesine dikkat edin. Bu nedenle, doğrudan harm station tampon çözeltisinden suya geçiyorum ve lamı yıkıyorum. Birkaç dakika boyunca, hareketin yanlara doğru değil, sadece yukarı ve aşağı olduğundan emin olun.

Ayrıca lamın su seviyesinin üzerinde kalmadığından emin olun ve lamı hemen izopropanole aktarın. Lam burada birkaç dakika daha bekletilir. Ardından, lütfen sayfanızı oda sıcaklığında beş dakika boyunca bekletin.

700 R.Cool. Böylece lamımız hibridizasyona hazır hale geldi; lamı tozdan korumak için bir lam kutusunda saklamanız daha iyi olacaktır. Hasat istasyonu için lift veya slip kullanacağız.

Kapak camının üzerinde beyaz şeritler bulunmaktadır; bunlar bir miktar yükselti sağlayarak numunenin kapak camı ile lam arasına girmesi için boşluk oluşturacaktır. Burayı etanol ile temizliyorum ve ardından yerleştirip herhangi bir toz partikülü kalmadığından emin oluyorum. İlk olarak, baskı alanının işaretli olduğu şablon lamımızı alacağız ve üzerine hazırladığımız lamı yerleştirerek mükemmel şekilde hizalandıklarından emin olacağız.

Kusursuz bir şekilde hizalandıklarından emin olun. Ayrıca, aşağıya bakacak olan tarafta şeritlerin olduğundan emin olmanız gerekir. Görmesi gerçekten zordur, ancak görebildiğinizden emin olun.

Şeritler slaytların yanlarında olmalıdır. Örneğimizi yanlardan yükleyeceğiz. Küçük miktarlarda örnek alıyorum, bu yüzden önce 15 µL alıyorum ve yüklemeye lamelin köşesinden başlıyorum.

Yavaşça içeri doğru çekeceğim ve tüm alanı kapsamak için kenar boyunca ilerleyeceğim. Bu aşamada, herhangi bir hava kabarcığı oluşmamasına dikkat etmek çok önemlidir; kurumasını önlemek için lamların kenarlarına 15 µL daha migratör uyguluyorum. Böylece örneğimiz hazır hale gelir ve lamları, hibridizasyon sırasında lamı nemlendirmek için mikro kanallara sahip olan önceliklendirme odalarında inkübe edersiniz.

Slaydın altı köşesine 10 µL 3X SSC ekleyeceğiz. Kamarada altı yer vardı, pardon, her köşede ve her kenarda. Lamı, lamellenin kaymaması için gerçekten nazikçe taşıdığınızdan emin olun. Lamı düz bir şekilde yerleştirdiğinizde, koyduğunuz suya yapıştığını göreceksiniz ve lamelini kapatın. Vidaların sıkı olduğundan emin olun.

Konversasyon odasını 65 °C'lik su banyosunda inkübe edeceğiz, ancak onu doğrudan tabana yerleştirmek istemiyoruz. Bu nedenle, aşırı ısı transferini önlemek için bir plastik bariyer koyuyoruz. Ardından, iyonizasyon odasını nazikçe yerleştiriyoruz ve herhangi bir yer değiştirmeyi önlemek için üzerine bir ağırlık da koyabilirsiniz.

Bu inkübasyon gece boyunca, tipik olarak 10 ila 12 saat arasında sürecektir. Kesitlerin yıkama işlemi için %0,05 SDS içeren 1X SSC kullanıyoruz. Bu işlem, lameli çıkarmak içindir.

Bu, yıkamanın ilk adımı olacak. Ardından, elimizdeki tüm SDS'leri kullanarak sadece %0,06 altı XSC ile iki adım daha gerçekleştireceğiz. Hazırlıkları tamamlayıp lamları alıyoruz ve yüzeyleri aşağı bakacak şekilde kapların içine yerleştiriyoruz.

Ardından yanlara doğru sallayacağız ve lamelin yavaşça düştüğünü göreceğiz. Tamam, ve şimdi, XES içeren diğer yıkama tamponuna aktaracağız. Bir dakika boyunca bekleyin.

06 XSSC'ye geçin. Tüm FDS'leri temizlediğimizden emin olmak için işlemi bir kez daha tekrarlayacağız. Oda sıcaklığında, 700 RP'de beş dakika boyunca kurutma santrifüjü yapın. Işığa duyarlı olduğu için bu lamı lam kutusunda saklayın.

Bu, lam tarayıcıdır ve lamı buraya, tam şu küçük boşluğa, etiket kısmı size bakacak şekilde yüzü aşağıya gelecek şekilde yerleştireceksiniz. İkinci lamda ise sadece taramak istediğiniz alanı belirleyeceksiniz. Lamlarımızdaki bu alanı seçeceksiniz. Lamlarımızı basmak için 16 pin kullandık.

Böylece her blok bir pine karşılık gelir ve lamlarımız 8.000'den fazla spot içerir. Yaklaşık 4.000 gen olduğu için vi renk genomunu iki kez temsil ediyoruz. Dolayısıyla, kullandığımız her oligo için iki spotumuz bulunmaktadır.

Ve burayı yakınlaştırırsanız, bu özel deneyde transkripsiyon regülatör mutantlarını yaban tip ile karşılaştırdığımızı görürsünüz; mutantlar kırmızı renk veren scifi ile işaretlenmiştir. Yaban tip ise yeşil renk veren site üç ile işaretlenmiştir. Dolayısıyla, bu noktalar gibi kırmızı görünen her şey, mutanttaki transkript bolluğunun yaban tipten daha yüksek olduğunu göstermektedir.

Böylece bunlar kırmızı veya kırmızının tonlarında görünürler ve yeşil görünen her şey, transkript bolluğunun mutant ile karşılaştırıldığında vahşi tipte daha yüksek olduğunu gösterir. Sarı görünen herhangi bir nokta ise, söz konusu transkriptin hem mutantta hem de vahşi tipte eşit miktarda bulunduğunu belirtir. Dolayısıyla, üst üste geldiklerinde, bu noktalar gibi sarı görünürler.