Patojen İlişkili Moleküler Desen (PAMP) Triggered Tesisleri Bağışıklık (PTI) için Testi

Merhaba, ben Voice Thompson Bitki Araştırmaları Enstitüsü'ndeki Greg Martin laboratuvarından Suma TI. Bugün size PAMP tetiklemeli bağışıklık veya PTI için hücre ölümü tabanlı bir analiz prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, bir genin PTI'daki rolünü araştırmak için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. İşleme, Nicotiana ANA bitkilerini yaklaşık yedi haftalık olana kadar yetiştirerek başlayın. Başlangıçtan dört ila beş gün önce.

PAM tetikli bağışıklık veya PTI deneyi. Bitkileri, tüm koltuk dallarını ve çiçekleri temizleyecek şekilde budayın. Bitkilerin daha kolay yönetilebilir olması için koltuk dallarını ortaya çıktıktan kısa bir süre sonra çıkarmaya çalışın.

Bitkiler hazırlandıktan sonra bakteri üretim aşamasına geçiniz. Bu prosedür, challenge bakterileri ile yapılacak ikinci bir inokülasyondan önce bitki immünitesini indüklemek için patojen olmayan bakteriler kullanır; analizde kullanılan tüm bakterilerin üretimini başlatınız. Aynı zamanda, her bir pseudomonas bakteri stoğu için pseudomonas bakterilerinin dondurulmuş gliserol stoklarını kullanınız.

Uygun antibiyotiği içeren bir KBM plağının merkezine az miktarda bakteri yayın ve plağı yaklaşık 18 ila 24 saat boyunca 30 °C'de inkübe edin. Agrobacterium için, iki mL lb içinde sıvı kültür başlatmak amacıyla önceden hazırlanmış taze bir plak kullanın. Ertesi gün, çalkalamalı inkübatörde 30 °C'de gece boyunca büyütün.

Pseudomonas bakterilerinin bulunduğu plakalara 150 ila 200 µL sıvı KBM ekleyin. Bakterileri plakanın tamamına yayın. Bunun için steril bir yayma çubuğu kullanın.

Plakaları tekrar inkübatöre yerleştirin ve 20 ila 24 saat daha bekletin. Dört agrobacterium. 20 micromolar asetona sahip yaklaşık beş ila 10 mililitre LB içerisinde sekonder bir kültür başlatın.

Kültürü 30 °C'de, çalkalamalı olarak gece boyunca büyütün. Bakterileri hazırladıktan sonra, PTI analizini gerçekleştirmeden bir gün önce analize yönelik bitki hazırlıklarına geçin. Bakterilerin hazırlanmasının ardından bitkileri, yaklaşık %35 ila %40 bağıl neme sahip, sabit ışıklı ve 22 ila 24 °C sıcaklıktaki bir odaya taşıyın.

Ardından, yapraklar üzerine daireler çizmek için kalın siyah bir markör kullanın. İyice genişlemiş yaprakları seçin; yaşlı yapraklardan veya dokunulduğunda sert veya kalın olan yapraklardan kaçının. Yaprağın alt kısımlarını işaretlemekten kaçının.

Dairelerin çapı en az 1.5 santimetredir ve yaprak başına iki ila dört daire işaretlenebilir. Daireler arasında yeterli mesafe olmalı ve tercihen büyük bir damarı kesmemelidir. PTI analizine, PTI indüksiyonunda kullanılan bakterileri hasat ederek başlayın.

Kullanılan pseudomonas türleri, iyi büyümeye işaret eden bir bakteriyel çim tabakası oluşturmuş olmalıdır. Bunları, steril uzun bir tahta çubukla sıyırarak plakadan toplayın ve agrobacterium santrifüjü için yaklaşık 20 ila 25 mililitre 10 millimolar Magnezyum klorür çözeltisi içinde yeniden süspande edin.

Hücreleri toplamak için kültürü santrifüjleyin ve yaklaşık 20 ila 25 mililitre 10 milimolar magnezyum klorür ile 10 milimolar MES pH 5.6 içerisinde yeniden süspande edin; santrifüj işlemini tekrarlayın ve hücreleri tekrar yaklaşık 20 ila 25 mililitre magnezyum klorür artı MES çözeltisi içerisinde yeniden süspande edin. Artık indükleyici pseudomonas ve agrobacterium bakterileri yeniden süspande edilmiştir.

Her üç kültürün optik yoğunluğunu 600 nanometre dalga boyunda ölçün. Pseudomonas için magnezyum klorür ile, Agrobacterium için ise MES artı magnezyum klorür ile hücreleri seyrelterek OD değerini ayarlayın. Gerekli nihai OD değerleri beraberindeki yazılı protokolde yer almaktadır.

Toplam 25 mililitre bakteriyel kültür, yaklaşık 40 ila 50 noktanın inoküle edilmesi için yeterlidir. Şimdi, iğnesiz bir mililitrelik şırınga kullanarak PTI indükleyicilerini yapraklardaki önceden işaretlenmiş dairelere infiltre ederek deneye başlayın. Bitkilerin infiltre edilme sırasını ve indüksiyonu takiben infiltrasyonun başladığı tam saati not edin.

İndüksiyon inokülasyonundan birkaç saat sonra challenge inokülasyonuna geçiniz. Challenge inokülasyonu için gerekli bakteri suşlarını, indükleyici pseudomonas suşları için daha önce gösterildiği şekilde hasat ediniz. Kültürlerin OD değerini tekrar ölçünüz ve konsantrasyonlarını ekteki GR protokolüne göre ayarlayınız.

Challenge inokülasyonuna, indükleyici infiltrasyondan yedi saat sonra başlayın. Aşağıdaki indükleyici-challenge kombinasyonlarını kullanın. İlk inokülasyon çemberinin çevresinden bir noktayı, ikinci inokülasyon çemberinin merkezi olarak seçin.

Challenge infiltrasyonunu, indüksiyonla aynı bitki sırasına göre gerçekleştirin. Bir yaprak üzerinde birden fazla nokta varsa, infiltrasyonların üst üste binmediğinden emin olun. Son olarak, assay'de kullanılan tüm kültürlerin seri dilüsyonlarını, uygun antibiyotikleri içeren KBM veya LB plaklarına ekin.

Challenge inokülasyonundan iki gün sonra, indüksiyon ve challenge inokülasyonlarından iki gün sonra PTI yanıtı değerlendirilmeye başlanabilir; PST DC 3000 ile challenge edilen bölgelerde, efektör tetiklemeli bağışıklık veya ETI kaynaklı hücre ölümünün ortaya çıkışı gözlemlenir. İnfiltrasyonun örtüşen alanındaki hücre ölümü, PTI'nın bozulduğunu gösterir ve pozitif fenotip olarak puanlanmalıdır. İndüksiyon ve challenge inokülasyonlarından dört ila beş gün sonra, DC 3000 hop Q1 mutantı veya PS back high ile challenge edilen bölgelerde hastalığa bağlı hücre ölümünün ortaya çıkışı gözlemlenir. İnfiltrasyonun örtüşen alanında hastalığa bağlı hücre ölümü ile belirtilen PTI bozulması aranır. Bitkiler, PTI'sı bozulmamış olanlar da infiltrasyonun örtüşen alanında hücre ölümü göstermeye başlayana kadar gözlemlenmeye devam edilir.

FLS iki geni susturulmuş bitkiler, PFDC kombinasyonu ile inokülasyondan iki gün sonra PTI açısından yetersiz kalır. Hücre ölümü, örtüşen alanda görülmekte olup bu durum, herhangi bir geni susturulmamış PTI kontrol bitkilerinin kontrolünün bozulduğunu göstermektedir. Bu bitkiler de PFDC kombinasyonu ile inoküle edilmiş ve analizden iki gün sonra incelenmiştir; normal bir PTI yanıtı nedeniyle, zorlama kaynaklı hücre ölümü örtüşen alanın dışında görülmekte ancak içinde görülmemektedir.

Bu prosedürü uygularken, bitki tetiklemeli bağışıklık (PTI) için hücre ölümü tabanlı bir analizinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk. Bitkileri önerdiğimiz çevresel koşullarda tutmayı hatırlamanız önemlidir. Daha yüksek nem seviyeleri bitkileri olumsuz etkileyecek ve analizin daha hızlı ilerlemesine neden olacaktır.

Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.