Nicel Değerlendirme Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi kullanarak Maya Lipidome

Bu protokol, maya lipid profilinin ana bileşenlerinin hızlı bir şekilde analiz edilmesine olanak tanır. İşlem, maya hücrelerinin hasat edilmesi ve yıkanmasıyla başlar. Yıkanmış hücreler, bir iki oranındaki kloroform ve metanol karışımına yerleştirilir ve cam boncuklar kullanılarak lizize edilir.

Kloroform ve su eklenmesi iki fazı birbirinden ayırır. Organik faz toplanır, kurutulur ve ardından lipid filmi, kütle spektroskopisi öncesinde saklanmak üzere kloroform içinde çözülür. Ekstrakte edilen lipidler, amonyum hidroksit ile kloroform ve metanolde seyreltilir ve dahili standartların bir karışımı eklenir.

Lipid solüsyonu artık doğrudan kütle spektrometresine enjekte edilebilir. Merhaba, ben Concordia Üniversitesi Biyoloji Bölümü'ndeki Vladimir Teco laboratuvarından Simon Bork. Bugün size kütle spektroskopisi kullanarak maya lipidlerini miktar belirleme yöntemini göstereceğim.

Laboratuvarımızda, farklı büyüme koşulları altında maya lipidlerindeki değişimleri incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, daha önce hazırlanmış dondurulmuş maya peletlerini 1,6 mililitre buz gibi soğuk distile su içinde yeniden süspande edin ve hücre süspansiyonundan 1,6 mililitreyi yüksek hızlı cam santrifüj tüplerine aktarın.

Bu prosedür boyunca, ekstrakte edilen lipidlerle yapılan tüm işlemlerin cam pipetler veya şırıngalar kullanılarak gerçekleştirildiğine dikkat edin. Plastikler yüksek bir arka plan sinyali oluşturacağından, kloroform ile temas etmeleri durumunda lipid ekstraksiyonuna, hücre süspansiyonuna bir eppendorf tüpünde ölçülmüş bir ila iki oranında kloroform metanol karışımının altı mililitresi ve 0,8 mililitre cam boncuk ekleyerek başlayın. Kloroform, metanol ve suda süspande edilmiş maya için bir ila iki ila 0,8 oranı korunduğu sürece kesin hacimler kritik değildir. Vorteksleyin.

Hücre süspansiyonu ve cam boncuklar, her biri bir dakika sürecek şekilde iki kez karıştırılır; ardından iki mililitre kloroform eklenip nazikçe karıştırılır ve oda sıcaklığında ara ara karıştırılarak beş dakika inkübe edilir. Beş dakikalık inkübasyonun ardından iki mililitre distile su eklenir ve nazikçe karıştırılır. Daha sonra, oda sıcaklığında ara ara karıştırılarak tekrar beş dakika inkübe edilir.

Burada da, kloroform, metanol ve su için spesifik bir hacimden ziyade 2:2:1,8 oranını korumak daha önemlidir. İkinci inkübasyon tamamlandığında, oda sıcaklığında 3000 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin, bu ilk ekstraksiyondan elde edilen tüm süpernatantı yeni bir yüksek hızlı cam santrifüj tüpüne toplayın ve ikinci bir lipid ekstraksiyonu için kalan hücre peletlerine 3,2 mililitre kloroform ekleyin.

Hücre peletlerini eklenen kloroform ile iki kez, her seferinde bir dakika boyunca vorteksleyin. Ardından, oda sıcaklığında 3000 Gs hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin; bu ikinci ekstraksiyondan elde edilen süpernatantı, ilk ekstraksiyon sonrası toplanan süpernatanta ekleyin. Son olarak, toplanan süpernatantları beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Ekstrakte edilen lipidler, oda sıcaklığında 3000 Gs'de santrifüj edildikten sonra alt organik fazda çözünmüş durumdadır. Üstteki sulu fazı atın ve alt fazı yeni bir yüksek hızlı cam santrifüj tüpüne aktarın. Kütle spektrometresinde daha temiz spektrumlar elde etmek için organik fazı oda sıcaklığında 3000 Gs'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve tüm süpernatanı bir cam viyale aktarın.

Çözünmüş lipidleri azot altında kurutun, kuruyan lipid filmini 500 µL kloroform içinde çözün ve örnekleri kütle spektrometrisi ile analiz etmeye hazır olana kadar -20 °C'de saklayın. Ekli yazılı protokolde yer alan tablo bir'de listelendiği gibi, kloroform içinde lipidlerin standart bir karışımını hazırlayarak başlayın. Her bir lipid farklı bir sınıfı temsil etmektedir.

Bu çözelti, ekstrakte edilen lipidlerin kütle spektrometresine enjekte edilmesinden önce daha sonra kullanılmak üzere -20 °C'de saklanabilir. Numunenin 10 µL'si ile lipid standart karışımının 10 µL'si birleştirildi. Standart-numune oranının gerektiğinde değiştirilebileceğini unutmayın.

Örnek ve standart lipid karışımını, dakikada 1 µL akış hızında çalışan bir nano elektrospray kaynağı ile donatılmış bir Q-TOF kütle spektrometresi kullanarak ayrıştırın. Ayarlar, beraberindeki yazılı protokolün tablo 2'sinde ayrıntılı olarak belirtilmiştir. Bir Q-TOF kütle spektrometresinin yüksek çözünürlüğünün kullanılması avantajlı olsa da, bu zorunlu bir gereklilik değildir.

Kesin cihaz parametreleri kütle spektrometreleri arasında farklılık gösterecektir. Veri toplama işleminden sonra, kütle spektrumları düzeltilir, arka plan çıkarılır ve pikler merkezlenir. Son olarak, pik listesini excel'e aktarın.

Ardından, her bir lipid camının piklerini dahili standartlarına göre normalize edin. Uygulamaya bağlı olarak, izotop giderme ve dekonvolüsyon gibi daha fazla son işlem gerçekleştirmek gerekebilir. Bu yöntem, maya lipid havuzunun ana bileşenlerinin hızlı ve derinlemesine belirlenmesine olanak tanır.

Burada, izotopik dekonvolüsyonu yapılmış ve iç standardına göre normalize edilmiş bir lipidi vurguladık. Maya lipidlerinin nasıl izole edileceğini ve elektrospray iyonizasyon kütle spektrometrisi kullanılarak maya lipidinin nasıl belirleneceğini size göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, plastik kullanımından kaçınmanın ve örneğinizi konsantrasyonların doğrusal aralığında tutmanın önemli olduğunu unutmayın.

Bu yöntem oldukça esnektir ve birçok hacim, ihtiyaç duyulduğunda değiştirilebilir. Bu ekstraksiyon protokolü, ince tabaka kromatografisi ve çok boyutlu kütle spektroskopisi gibi diğer lipid analiz yöntemleri için de uygundur. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.