Stemgent İnsan TF lentivirüs İnsan Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi ayarla

Merhaba, benim adım Brad Hamilton. STEM Gen'in Araştırma ve Geliştirme departmanında görev yapan bir bilim insanıyım. Bugün size, lentiviral yolla iletilen yeniden programlama faktörlerini kullanarak insan fibroblastlarının nasıl yeniden programlanacağına dair bir prosedür göstereceğiz.

Bu prosedür, hem iPS hücreleri üretmek hem de yeniden programlama sürecini incelemek için kullanılabilir. iPS hücreleri; morfoloji, proliferasyon, farklılaşma yeteneği ve vücudun tüm doku türlerine dönüşebilme özellikleri bakımından ES hücrelerine benzerler. İnsan iPS hücreleri, hücreleri elde etmek için bir embriyoyu yok etmenin getirdiği etik ikilem olmadan ES hücrelerinin temel özelliklerini sergiledikleri için ES hücrelerine göre belirgin bir avantaja sahiptir.

Hastaya özgü iPS hücrelerinin üretimi, otolog olmayan nakledilmiş hücrelerin immün reddedilme olasılığını ortadan kaldırarak kişiselleştirilmiş rejeneratif tıp tedavilerinin önündeki önemli bir engeli aşmaktadır. Öyleyse başlayalım. Bu protokolün çeşitli aşamalarında, gelişmekte olan iPSC veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin besiyerini, meth kondisyonlu besiyeri ile değiştireceksiniz.

Bu ortamın hazırlanması altı gün sürer. Bu nedenle, deneyinize başlamak istediğiniz tarihten en az bir hafta önce hazırlıklara başlayın. Başlamak için, altılı bir plağın her kuyucuğuna ekim yapın.

İki mililitre meth büyüme ortamında 2 × 10⁵ cfu meth feeder hücreleri içeren kuyucuklu plak, 37 °C ve %5 karbon dioksit altında gece boyu inkübe edilir. Ertesi gün, ortam insan E-S-I-P-S hücre kültürü ortamı ile değiştirilir.

Besiyerini 37 °C ve %5 karbondioksit altında gece boyunca inkübe edin. Süpernatantı toplayın ve dört gün boyunca her 24 saatte bir taze besiyeri ile değiştirin. Süpernatantı 0,22 µm'lik bir filtreden süzün.

Toplanan süpernatantı, mililitre başına 15 nanogram BFGF bazal fibroblast büyüme faktörü ile destekleyin. Toplamda yaklaşık 16 mililitre meth kondisyonlu ortam elde edeceksiniz; her gün toplanan süpernatantı 4 °C'de ayrı ayrı saklayın. Meth kondisyonlu ortam 4 °C'de bir ila iki hafta veya -20 °C'de birkaç ay boyunca saklanabilir.

Met kondisyonlu ortamınızın ihtiyacınız olduğunda hazır olduğundan emin olduğunusa göre, hücrelerin hazırlanması hakkında konuşalım. iPSC oluşturmadaki ilk görev, lentivirüsler kullanarak insan sünnet derisi fibroblast hücrelerini veya BJ hücrelerini, kök hücrelerin karakteristik dört transkripsiyon faktörü ile transdüse etmektir. Transdüksiyona hazırlanmak için, BJ hücrelerini altı kuyucuklu bir plakadaki kuyucuk başına 1×10⁵ hücre yoğunluğunda ekleyin ve kültüre edin.

Hücreler, aynı gün içinde 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında, iki mililitre büyüme ortamında gece boyunca inkübe edilir. Altı kuyucuklu bir plakaya, su ile seyreltilmiş 0,1% jelatinin iki mililitresi eklenip 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında gece boyunca inkübe edilerek besleyici plakaların hazırlanmasına başlanır. Jelatin, kuyucukları kaplayarak hücreler için bir matriks görevi görür.

Artık BJ hücreleri, transdüksiyon için virüsü hazırlamak amacıyla lentiviral transdüksiyona hazırdır. İki mililitre taze besiyerini, mililitre başına altı mikrogram polybrene ve her biri insan transkripsiyon faktörlerinden birini eksprese eden dört lentivirüs (T4, SO2, nanog ve lin28) ile destekleyin; öyle ki her biri aynı enfeksiyon çokluğu veya MOI değerinde olsun.

Bu lentivirüslerin tamamı insan yeniden programlama faktörü lentivirüs setinde yer almaktadır. Transdüksiyonu gerçekleştirmek için BJ hücre büyüme ortamını, virüs içeren ortamla değiştirmeniz yeterlidir. Ortamın tabana eşit şekilde yayılması için plakayı nazikçe sallayın.

Aynı gün, 37 °C'de ve %5 karbondioksit ortamında gece boyunca inkübe edin. Sıvı azottan bir şişe cf one meth feeder hücresi çıkarın ve çözdürün. Jelatin solüsyonunu, her biri şu an jelatin kaplı olan meth feeder plaklarından uzaklaştırın.

İki mL meth büyüme ortamına 0,2 × 10⁵ hücre ekleyin. MES'i 37 °C'de ve %5 karbondioksit altında gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, BJ hücrelerini %0,05 tripsin EDTA ile ayırın ve beş dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin.

Santrifüj işleminin ardından, süpernatan aspire edilsin ve hücreler büyüme ortamında yeniden süspande edilsin. Meth feeder plağındaki ortam uzaklaştırılsın ve her kuyucuğa iki mililitre BJ hücre süspansiyonu eklensin. BJ hücre konsantrasyonu, kuyucuk başına yaklaşık 5 × 10⁴ hücre olmalıdır.

37 °C'de ve %5 karbondioksit ortamında gece boyunca inkübe edin. BJ hücrelerinin meth feeder plağı üzerinde yerleşmesinden 24 saat sonra, besiyerini insan E-S-I-P-S (embriyonik kök hücre veya indüklenmiş pluripotent kök hücre kültür besiyeri) ile değiştirin. Besiyeri değişimine yedi gün boyunca her 24 saatte bir devam edin.

Yedinci günde, ES hücre kültür ortamını iki mililitre meth kondisyonlu ortam ile değiştirin. Meth feeder hücreleri, iPS hücrelerinin büyümesi için gereken çözünür faktörleri sağlamaktaydı. Ancak şimdi, kültürün sağlıklı kalmasını sağlamak için bu faktörlerden daha fazlasını eklememiz gerekiyor.

Meth koşullandırılmış ortam, 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında gece boyunca inkübe edilen meth besleyici hücreleri tarafından salgılanan tüm çözünür faktörleri içerir. Mikroskop altında bir hücre kolonisi seçin. 24 saat önce ccf-1 meth besleyici hücreleri ile hazırlanmış taze bir 24 kuyucuklu plakada, küçük kompakt kubbe benzeri görünümüyle ayırt edilen seçili koloniyi insan E-S-I-P-S kültürüne aktarın.

10 µM stem molekül Y 2 7 6 3 2 ile takviye edilmiş besiyeri. Bağımlı bir kinaz inhibitörü. İlk yedi gün boyunca, her 24 saatte bir stem molekül Y 2 7 6 3 2 takviyesi yapmadan kültür besiyerini değiştirin.

Yedi gün sonra besiyerini meth. Condition besiyeri ile değiştirin. Hücreler tipik insan ES hücresi morfolojisi gösterene kadar pasajlamaya devam edin. Keskin kenarlı, küçük ve kompakt kubbe benzeri koloniler arayın.

Koloniler tekdüze olmalı ve çekirdek-sitoplazma oranı yüksek olmalıdır. Bu noktada, ES hücreleri morfolojisine sahip koloniler geliştirmiş oldunuz; ancak bu koloniler aynı zamanda ES hücrelerine özgü genleri de eksprese ediyor mu? Bunu belirlemek için kolonileri TRA 180 1, TRA one 60, SSEA four s, SE, a three, T four, sox, two, nanog ve SSEA one gibi pluripotens markerları için boyayın. Başlamak için hücreleri PBS ile üç kez nazikçe yıkayın.

Ardından, hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 500 µL %4 paraformaldehit veya başka bir fissat ile fikse edin. 20 dakika sonra, fazla fissatı uzaklaştırmak için hücreleri 3 kez daha PBS ile yıkayın. Sonra, hücreleri her kuyucukta 500 µL bloklama tamponu ile oda sıcaklığında bir saat inkübe ederek spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin. Bloklama adımından sonra, her birine bloklama tamponunda 1:100 oranında seyreltilmiş 250 µL primer antikor ekleyin.

Hücreleri bir gece boyunca 4 °C'de primer antikor ile inkübe edin. Bağlanmamış primer antikoru uzaklaştırmak için hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Hücreleri, 1:300 oranında seyreltilmiş sekonder antikor ve bloklama tamponu içeren 250 µL çözelti ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin; fotobeleçingden kaçınmak için sekonder antikorla inkübasyon sonrası ışık almayan bir yerde tutun.

Hücreleri üçüncü yıkamaya kadar üç kez PBS ile yıkayın. Çekirdekleri boyamak için mililitre başına bir mikrogram DPI ekleyin. Son olarak, iPS hücrelerinizin gen ekspresyonunu analiz edin.

Mikroskop altında morfoloji sonuçlarında, T4, SOX2, Nanog ve Lin28 ile birlikte transduce edilen insan dört deri fibroblast hücresinde, transduksiyon sonrası dördüncü gün kadar erken bir dönemde morfolojik değişiklikler gözlemlenmiş ve hücre kümeleri 17. günde daha sıkı paketlenmiş hale gelmiştir. İzole edilen iPS hücre kolonilerini daha ayrıntılı karakterize etmek için, ES hücrelerinde eksprese edilen yaygın pluripotensi markerlarının varlığını inceledik. Koloniler güçlü alkalin fosfataz aktivitesi göstermiştir.

Ek olarak, yüzey belirteçleri TA 180 1 TRA one 60 SSEA four ve SS EEA three ile nükleer belirteçler T four, SOX two ve Nanog'u içeren bir plüripotens belirteç spesifik antikor paneli ile iPS hücre kolonlarında immünokimya veya ICC gerçekleştirilmiştir. İzole edilen iPS kolonları tüm belirteçler için pozitif sonuç vermiştir. ICC sonuçları, iPS hücrelerinin uygun plüripotens belirteç ekspresyon paterni sergilediğini ve bu iPS hücrelerinin diferansiye olmamış insan ES hücrelerine yakından benzediğini göstermektedir.

İnsan fibroblastlarının stem gen'ler ile yeniden programlanması yoluyla iPS hücrelerinin nasıl üretileceğini size göstermiş olduk. İnsan yeniden programlama faktörü lentivirüs seti. Bu prosedür uygulanırken, birkaç faktörün dikkate alınması önemlidir.

İlk olarak, optimum transdüksiyon verimliliğine ulaşmak için primer transdüksiyon adımında aktif virüs/hedef hücresi oranı modifiye edilmesi gerekebilir. İkinci olarak, hedef hücrelerin büyüme koşulları etkili olabilir. Sağlıklı ve proliferatif hücrelerin yeniden programlanması, yeniden programlamaya daha uygundur.

Üçüncü olarak, protokol farklı hücre sayıları için modifiye edilirken, hedef hücre sayılarının kültür kabının yüzey alanıyla orantılı olarak ayarlanması önerilir. Son olarak, güncel çalışmaların insan iPSC kolonlarının sağkalımını artırmadaki faydasını göstermesi nedeniyle, başarılı bir yeniden programlamayı sağlamaya yardımcı olmak için Y 2 7 6 3 2 gibi rock inhibitörlerinin uygulanması düşünülmelidir. İşte böyle.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.