GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Bu prosedürün genel amacı, OCT4, SOX2, KLF4 ve MYC'nin retrovirüs aracılı aşırı ekspresyonu ve bir GFP raporlayıcı sistemi kullanılarak insan iPS hücreleri üretmektir. Bu işlem, öncelikle uygun miktarda bireysel GFP eksprese eden retrovirüs eklenerek gerçekleştirilir. Ardından, GFP eksprese eden virüsle enfekte edilmiş hücreler, fare embriyonik fibroblastlarının bulunduğu %0,1 jelatin kaplı plakalara aktarılır.

Prosedürün üçüncü adımı, besiyerinin insan embriyonik kök hücre kültür besiyeri ile değiştirilmesidir. Son olarak, insan embriyonik kök hücrelerine benzer bir morfoloji gösteren GFP susturulmuş IPS kolonileri izole edilir. Nihayetinde sonuçlar, immünofloresan boyama ve R-T-Q-P-C-R aracılığıyla endojen pluripotent belirteçlerin ekspresyonunu göstermektedir.

Bu tekniğin, pluripotent yüzey belirteçleri ile yaşam boyu boyama ve morfolojik değişimlerin gözlemlenmesi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, istenen iPad'dir. Kültüre başlamak için, pluripotent hücrelerin bir belirteci olarak GFP ekspresyon kaybı kullanılarak hücre kolonileri kolayca izole edilebilir. Enfeksiyondan bir gün önce, fibroblast ortamında bulunan insan fibroblastlarını, altı kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna 1 × 10⁵ insan fibroblastı olacak şekilde ekin; ertesi gün ölü hücreleri uzaklaştırmak için ortamı aspire edin ve 5 µg/mL protamin sülfat içeren 2 mL taze fibroblast ortamı ekleyin.

Ardından, beşlik bir enfeksiyon çokluğuna (MOI) karşılık gelen miktarlarda her bir GFP eksprese eden virüsü dikkatlice ekleyin. Enfeksiyondan bir gün sonra hücreleri 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Viral süpernatantı uzaklaştırın ve iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın.

Ardından enfeksiyondan üç gün sonra iki mililitre fibroblast medyumu ekleyin. GFP floresansını kontrol edin ve kuyucuğu iki mililitre fibroblast medyumu ile tamamlayın. Ertesi gün, 0.1% jelatin ile kaplanmış 10 santimetrelik bir Petri kabına, fibroblast medyumu içerisinde santimetrekare başına 1 × 10⁴ ışınlanmış fare embriyonik fibroblastı veya MEF besleyici hücreleri ekin.

Hücreleri 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, enfekte insan fibroblastlarını 1 mL %0,05 tripsin EDTA ile 37 °C'de beş dakika boyunca ayırın ve 200 G'de beş dakika santrifüjleyin. Hücreleri 10 mL fibroblast besiyerinde yeniden süspande edin ve hücreleri önceden %0,1 jelatin ile kaplanmış mfs üzerine yeniden ekin. 24 saat sonra.

Besiyerini HESC kültür besiyeri ile değiştirin ve besiyerini her gün yenileyin. Enfeksiyondan 20 ila 27 gün sonra, floresan mikroskobunda ESC benzeri koloniler görülmeye başlayacaktır. HSC'lerle benzer morfoloji gösteren bir kolonide GFP floresansının yokluğunu kontrol edin.

10 µL'lik bir pipet kullanarak tekil iPSC kolonlarını seçin ve bunları jelatin ile meth kaplı, HESC ortamı ile desteklenmiş 12 kuyucuklu bir plağın bir kuyucuğuna yerleştirin. Besiyerini günlük olarak değiştirin ve plağı 1 mL DMM F 12 ile yıkayarak hücreleri pasajlayın.

Ardından 0.5 milliliter kollajenaz ekleyin ve 37 degrees Celsius'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri DM A MF 12 ile iki kez yıkayın. Sonrasında, iki milliliter taze HESC ortamı ekleyin.

Ardından, kolonileri küçük parçalara ayırmak ve plakada kalan hücreleri koparmak için bir hücre kaldırıcı kullanın. Yeniden süspanse edilen koloni parçalarını, jelatin ve MEF kaplı altı kuyucuklu bir plağın bir kuyucuğuna aktarın ve 37 °C'de iki gün boyunca inkübe edin.

Hücreleri immünofloresan yöntemiyle kontrol etmek için, hücreleri üç kez PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca %4 paraldehit ile fikse edin. Hücreleri nazikçe üç kez PBS ile yıkayın ve PBS içinde %0,2 tritton X 100 ile 30 dakika boyunca permeabilize edin.

Hücreleri iki saat boyunca PBS içinde %3BSA ile inkübe ederek non-spesifik bağlanmayı engelleyin. Ardından, hücreleri birincil antikor ile dört santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. Sonrasında hücreleri üç kez PBS ile yıkayın ve ikincil antikor ile oda sıcaklığında, karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin.

Son yıkama sırasında hücreleri üç kez PBS ile yıkayın. DAPI ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Kantitatif gerçek zamanlı analiz için hücreleri floresan mikroskop kullanarak görüntüleyin.

İnsan fibroblastlarından türetilen insan IPC'lerinden RNA izolasyon kiti kullanarak toplam RNA izole edin. Ters transkriptaz kullanarak birinci zincir cDNA sentezleyin.

Ardından, pluripotensi genlerini saptamak için bunu QPCR şablonu olarak kullanın. OCT 4, SOX 2, KLF 4 ve Myc taşıyan bir retrovirüs kokteyli ile enfekte edilen insan fibroblastları (BJ hattı) kullanılmıştır; burada, beşinci günden itibaren yeniden programlama sırasında gözlemlenen morfolojik değişiklikler gösterilmektedir. 10, 14 ve 21. günlerde, hücreler 21 gün sonra hESC benzeri morfoloji göstermeye başlar ve iPSC'ler GFP floresansı ile tanımlanır.

ESC'ler ve IPC'ler gibi pluripotent kök hücreler, proviral gen ekspresyonunu baskılamak için gerekli olan moleküler mekanizmayı eksprese ederler. Ancak, burada kullanılan retroviral vektörler, reprogramlama genlerini retroviral LTR aracılığıyla GFP ile birlikte eksprese ederler. Bu nedenle, sürekli GFP eksprese eden hücrelerin, proviral gen susturulması olmaksızın transgenleri eksprese ettiği kabul edilir; burada sadık bir şekilde görüldüğü üzere, Pluripotency Molecular Network'ü edinen ve yeniden programlanmış IPSC kolonileri, GFP ekspresyonunun yokluğunu gösterir.

Bu şekil, Detroit 5 51 fibroblastlarından türetilen kolonilerin TRA 180 1, TRA one 60 SSEA four T four ve nano antikorları ile yapılan immünohistokimya analizini başarıyla göstermektedir. Yeniden programlanmış IPC'ler bu belirteçlerin tamamını eksprese etmektedir. Ek olarak, gen ekspresyonunu analiz etmek için kantitatif R-T-P-C-R uygulanmış ve T four SOX two, KLF four M ve nano'nun parental fibroblast hücrelerine kıyasla anlamlı şekilde arttığı, ancak H nine HSC'lerinkine uygun olduğu ortaya çıkmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, virüs enfeksiyonunun nasıl gerçekleştirileceği, tam olarak lip programlanmış IPA hücrelerinin floresan mikroskobu kullanılarak nasıl tanımlanacağı ve toplanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.