İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre seçme ve ayırma Kolonileri Yetişkin Fibroblastlar gelen reprogrammed

Bu video makalesinde, retroviral vektörler kullanılarak insan yetişkin fibroblastları, pluripotent kök hücreler üretmek için yeniden programlanmaktadır. İlk olarak, insan fibroblastları T three four, SOX two, KLF four ve cmic transkripsiyon faktörlerini kodlayan retroviral vektörlerle transdüse edilir.

Enfekte fibroblastlar, 14 ila 28 gün boyunca fare embriyonik besleyici hücreler üzerinde kültüre edilir. Oluşan kültürler, yeniden programlanmış hücre kolonilerini tanımlamak için TRA 180 1 antikoru ile boyanır. Pozitif koloniler daha sonra ekspansiyon için MEF içeren plakalara aktarılır.

İmmünositokimyasal boyama, pluripotens işaretçilerinin ekspresyonunu ve pluripotent kök hücre hatlarının oluşturulduğunu doğrular. Hatları daha detaylı karakterize etmek için ardından ek çalışmalar yürütülmelidir. Genellikle somatik hücre programlaması ve insan kaynaklı uyarılmış pluripotent kök hücre kültürlerinde yeni olan kişiler, doğru iPSC kolonilerini tanımlamanın zorluğu nedeniyle güçlük çekeceklerdir.

Prosedürü, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Dr. Sula Pollak gerçekleştirecektir. Bu prosedüre, Phoenix AM FO hücrelerini, 10 santimetrelik plak başına yaklaşık 7 ila 8 milyon hücre yoğunluğunda, 10 mililitre yüksek glukozlu DMEM içinde plaklayarak başlayın; ardından inkübatöre yerleştirin ve gece boyunca kültürleyin. Ertesi gün, ya T34SOX, 2klf, 4cmic veya GFP genini kodlayan 12 mikrogram vektör ve 35 mikrolitre Fugene 6'dan oluşan, L-glutamin içeren serumsuz yüksek glukozlu DMEM ile toplam hacmi 500 mikrolitreye tamamlanmış transfeksiyon karışımları hazırlayın.

Karışımları 20 dakika boyunca inkübe edin. Ardından phoenix hücrelerini transfekte etmek için, %70 ila %80 yoğunlukta (konflüen) olması gereken phoenix hücrelerini içeren plaklara DNA komplekslerini nazikçe pipetle aktarın. Altı ila sekiz saat sonra hücreleri 37 °C'de inkübe edin.

Besiyerini aspire edin ve yerine antibiyotikli sekiz mililitre yüksek glukozlu DMEM ekleyin. Ardından plakları inkübasyon sonrası 12 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Virüs içeren besiyerini aspire etmek ve toplamak için bir pipet kullanın.

Ardından besiyerini değiştirin ve besiyeri dört kez toplanana kadar bu işlemi her 12 saatte bir tekrarlayın. Besiyerini dört santigrat derecede saklayın. Tüm besiyeri toplandıktan sonra, tüm porsiyonları birleştirin ve ardından ayrılmış hücreleri ve kalıntıları uzaklaştırmak için karışımı 0,45 mikrometre tüp üstü filtreden geçirerek 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Viral partiküller içeren filtrelenmiş besiyeri, enfeksiyöz aktivite kaybı olmaksızın iki hafta boyunca buzdolabında saklanabilir. Dondurma işlemi önerilmemektedir. Transdüksiyon prosedüründen bir gün önce, dondurulmuş yetişkin insan fibroblast stokları çözülür ve jelatin kaplı altı kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna 1 × 10⁵ hücre eklenir.

Ertesi gün, 50 mililitrelik konik bir tüpte, 3,5 mililitre T four SOX two, klf four ve cmic viral ortamını birleştirin ve kontrol olarak son konsantrasyonu altı mikrogram/litre olacak şekilde poly brain ekleyin. Bir mililitre GFP viral ortamı, üç mililitre kültür ortamı ve son konsantrasyonu altı mikrogram/mililitre olacak şekilde poly brain hazırlayın. İnsan fibroblastlarını içeren plakadaki ortamı aspire edin.

Ardından dört mililitre karışık viral medyum veya kontrol medyumu ekleyin ve plakları 20 °C'de bir saat boyunca 1600 G'de santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından plakları yaklaşık 12 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra viral medyumu fibroblast kültür medyumu ile değiştirin ve 12 saat daha inkübe edin.

Enfeksiyondan fibroblast ortamında kültüre kadar olan bu işlemi, son enfeksiyondan sonra iki kez daha tekrarlayın. Fibroblastları 48 saat boyunca DMEM içerisinde kültüre edin. Ardından, GFP retroviral ortamı ile paralel transdüksiyonların enfeksiyon verimliliğini kontrol edin.

Somatik hücrelerden pluripotent hücrelere yeniden programlamayı başlatmak için; enfekte edilen fibroblastlar, insan embriyonik kök hücre medyumu veya HES medyumu içerisinde kültüre edilir. Fare embriyonik fibroblastları veya MEF'ler, jelatinle işlem görmüş altı kuyucuklu plakada, kuyucuk başına yaklaşık 2 × 10⁵ hücre yoğunluğunda, fibroblast büyüme medyumu kullanılarak ekilir ve ertesi gün işleme geçilir.

Enfekte insan fibroblastlarını %0,05 tripsin EDTA kullanarak ayırın ve fibroblast büyüme ortamında kuyu başına yaklaşık 1,2 × 10⁴ yoğunlukta ekleyin. Ertesi gün, yeniden programlamanın ilk yedi günü boyunca ortamı 0,5 mM sodyum bütirat içeren HES ortamı ile değiştirin.

Besiyerini her gün değiştirin. Besiyerini sodyum bütirat içermeyen HES besiyeri ile değiştirin ve yeniden programlamayı yedi ila 21 gün daha sürdürün. Besiyerini her gün düzenli olarak değiştirin.

Transdükte hücreleri morfolojik değişiklikler açısından kontrol edin. Transdükte fibroblastların feeder hücrelerin üzerine aktarılmasından yaklaşık 10 gün sonra hücre kolonileri belirmeye başlayacaktır. Yeniden programlanmış hücreleri içeren koloniler artık insan indüklenmiş pluripotent kök hücreleri veya insan IPS hücreleri olarak adlandırılır.

İnsan iPS hücre kolonileri, MEF feeder hücreleri üzerine ekildikten 14 ila 28 gün sonra izolasyona hazır hale gelecektir. Bu aşamada, insan iPS hücre kolonileri burada ya MEF içeren ya da matrigel kaplı plakalara aktarılabilir. MEF içeren plakalara aktarma işlemi, insan iPS hücre kolonilerini toplamanın bir gün öncesinde gösterilmiştir. Gamma radyasyonuna maruz bırakılmış MEF feeder hücreleri içeren 24 kuyucuklu plakaları fibroblast büyüme ortamında ekle.

İnsan iPS hücre kolonilerinin seçileceği gün 37 °C'de %5 CO2 ile inkübe edin. ME F'lerinden fibroblast büyüme ortamını aspire edin ve FBS kalıntılarını temizlemek için PBS ile durulayın. Ardından, her bir kuyucuğa 10 µM rock inhibitörü Y 2 7 6 3 2 içeren 0,5 mL insan embriyonik kök hücre veya HES ortamı ekleyin; ardından, laminar akışlı kabin içine monte edilmiş bir mikroskop kullanarak, yeniden programlama plakalarını insan iPS hücre kolonisi oluşumu açısından inceleyin.

Gerekiyorsa, insan IPS hücre kolonlarını çevreleyen fibroblastları 21 gauge bir iğne ile uzaklaştırın. Plakaları PBS ile durulayın ve TRA 180 1 lekesine özgü canlı hücre antikoru içeren taze HES medyumu ekleyin. Hücreleri 37 °C sıcaklıkta ve %5 CO2 içeren inkübatöre geri yerleştirin.

30 dakika sonra, ortamı 10 µM rock inhibitörü ile desteklenmiş taze HES ortamı ile değiştirin. Ardından kolonları floresan mikroskop altında inceleyin. TRA-1-81 pozitif kolonları işaretleyin.

21 gauge iğne ve objektif bir belirteç kullanarak TRA 180 1 pozitif insan iPS hücre kolonilerini birkaç küçük parçaya bölün. Ardından, otomatik bir pipet kullanarak insan iPS hücre kolonisi fragmanlarını, ME F içeren 24 kuyucuklu plakanın münferit kuyucuklarına aktarın. iPS hücresi olmayan hücrelerin aktarılmasından kaçının.

Plakaları inkübatöre yerleştirin ve insan iPS hücre kolonilerinin tutunması için 24 ila 36 saat bekletin; besiyerini her gün değiştirin. Doğru HE benzeri morfolojiye sahip insan iPS hücre kolonileri, 24 kuyucuklu plağa ilk transferden 48 saat sonra görünür hale gelecektir; insan iPS hücre kolonilerini her altı ila sekiz günde bir 21 gauge iğne ile keserek manuel olarak pasajlayın. Klonal genişlemeden sonra kültürleri önce 12 kuyucuklu ve ardından 6 kuyucuklu plağa genişletin.

İnsan iPS hücre hatları oluşturulduktan sonra; TRA-1-60, SSEA-4, T3, T4, SOX2 ve nanog gibi pluripotens işaretçilerinin ekspresyonu immünokimya kullanılarak analiz edilir. Ayrıntılı karakterizasyon; in vitro ve in vivo farklılaşma analizlerini, karyotip analizini, transgen susturulma analizini, metilasyon çalışmalarını ve gen ekspresyon çalışmalarını kapsayabilir.

Viral transduksiyonun etkinliğini belirlemek için, retrovirüs içeren ortamla yapılan verimli transduksiyon, başarılı yeniden programlama için kritik öneme sahiptir. Friedrichs ataksisi olan bir hastadan türetilen insan yetişkin fibroblastları, GFP retroviral ortamı ile yapılan iki ardışık enfeksiyondan sonra görselleştirilmiştir; fibroblastlar viral ortamla basit inkübasyon yoluyla enfekte edildiğinde, hücrelerin %20'sinden azı transdukte olmuştur. Ancak, GFP retroviral ortamının eklenmesini hemen takip eden işlemle transduksiyon verimliliği önemli ölçüde artmıştır.

İzole edilen insan iPS hücre kolonilerinin ilk karakterizasyonunu gerçekleştirmek için hücrelerin %80'inden fazlası burada transduce edilmiştir. İnsan ES hücrelerinin karakteristik özelliği olan pluripotens belirteçlerinin ekspresyonu, burada gösterildiği gibi immünokimya ile değerlendirilmiştir. İzole edilen insan iPS hücre kolonileri, pluripotens belirteçleri için pozitif sonuç vermiştir.

T three four, SOX two, nano SSEA four ve TRA one 60 DNA. Üst panellerde gösterilen DPI ile eş boyama, hem insan IPS hücre kolonilerinde hem de besleyici hücrelerde tespit edilmiştir. Bu sonuçlar, bu yeniden programlama protokolü kullanılarak elde edilen insan IPS hücrelerinin, farklılaşmamış insan pluripotent kök hücreleri için karakteristik olan uygun pluripotens markerlarını eksprese ettiğini göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, retroviral transfeksiyon kullanarak insan fibroblastlarının pluripotent kök hücrelere nasıl başarıyla yeniden programlanacağı, doğru insan indüklenmiş pluripotent kök hücre kolonilerinin nasıl belirleneceği ve hPSC'lerin başlangıç karakterizasyonunun nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.