Hücresel Self-Meclis Biyomekanik Analizi ve Doku Mühendisliği, Hücre-Türetilmiş Doku Yüzüklerin Üretiyor yönelik

Bu prosedürün genel amacı, fonksiyonel analizler için kullanılabilecek, agregat hücrelerden ve hücre kaynaklı matristen oluşan 3D doku konstrüktleri oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle yuvarlak tabanlı anüler kuyucuklar oluşturmak için bir polikarbonat kalıbın frezelenmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, bir şablon oluşturmak için polikarbonat kalıba polidimetilsiloksan veya PDMS dökülür.

Ardından, aros kuyucuklarını oluşturmak için PDMS kalıbı kullanılır. Son adım, hücrelerin kümelenmelerine ve birbirine bağlı doku halkaları oluşturmalarına olanak sağlamak için aros kuyucuklarına hücre ekmektir. Nihayetinde bu yöntem, farklı hücre tipleri kullanılarak hücresel kendi kendine düzenleme ve doku mühendisliği sağlamak için kullanılabilir; ayrıca hücrelerin ve hücre kaynaklı hücre dışı matriksin doku yapısına ve işlevine olan katkısının analiz edilmesine imkan tanır.

Bu tekniğin diğer doku mühendisliği yaklaşımlarına göre temel avantajı, tamamen hücrelerden ve bunların ürettiği hücre dışı matristen oluşan doku konstrüktlarını, daha önce rapor edilenlerden daha hızlı bir şekilde ve mekanik analize uygun bir formatta oluşturabilmemizdir. İlk olarak, merkez direk çapı iki milimetre olan 15 adet yuvarlak tabanlı anüler kuyucuk oluşturmak için yarım inç kalınlığındaki bir polikarbonat parçayı frezeleyin. Frezeleme işlemi sırasında oluşan plastik kalıntıları temizlemek için polikarbonat kalıbı temizleyin ve kalıbın kurumasını bekleyin. Ardından, PDMS'i baz ile kürleme maddesi şeklinde 10'a bir oranında karıştırın. Tüm hava kabarcıklarını gidermek için çözeltinin havasını alın ve ardından polikarbonat kalıba dökün.

Ardından, kalan hava kabarcıklarını gidermek için karışımı kalıp üzerinde tekrar vakumlayın ve PDMS'yi 60 °C'deki bir fırında dört saat boyunca kürleyin; PDMS kürlenirken %2 AROS'u DMEM içinde çözün. Kürleme tamamlandığında, PDMS şablonu polikarbonattan yavaşça soyarak dikkatlice çıkarın, ardından PDMS'yi sabunlu suyla yıkayın ve DMEM AROS çözeltisiyle birlikte otoklavlayın. Şimdi, otoklavlanmış PDMS şablonunu düz bir yüzeye yerleştirin ve önce her bir merkez sütun kalıbına, ardından onları çevreleyen boşluklara pipetle AROS ekleyerek şablonu erimiş AROS ile doldurun.

Arosların yaklaşık 15 dakika boyunca katılaşmasını bekleyin. Ardından, arosları PDMS'den ayırmak için kalıbı ters çevirin. Her bir kuyucuğun etrafındaki fazla aros kısımlarını kesin ve ardından her bir aros kuyucuğunu 12 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin.

Kuyucuğun üst kısmını kapatmadan, aros kuyucuğunun dış çevresine hücre kültür medyumu ekleyin. Ardından, hücreler hazırlanırken dengelenmeleri için plakaları inkübatöre yerleştirin. %90 konfluens seviyesinde, sıçan aortik düz kas hücrelerini tripsinize edin ve resüsode edin.

Hücreleri mililitre başına beş x 10⁶ hücre konsantrasyonunda süspanse edin. Ardından, yeniden süspanse edilen hücre süspansiyonundan her bir dengelenmiş aros kuyucuğuna 100 µL pipetleyin. Hücreleri her bir kuyucuğa uygulamak için dairesel bir hareket kullanın.

Plakları, 24 saat boyunca rahatsız edilmeden bekletilmek üzere inkübatöre yerleştirin. Kuyucuk çevresindeki medyumu aspire ederek ve ardından aros kalıbı tamamen suya gömülene kadar her bir kuyucuğu yeniden doldurarak medyumu her iki günde bir değiştirin. Kültür süreci sona erdiğinde, küçük bir Petri kabını PBS ile doldurun.

Her bir halkayı, merkez direğinin üzerinden kaydırarak aros kalıbından çıkarın. Halkaları, PBS Center içeren Petri kaplarına yerleştirin ve bir halkayı dijital görüntüleme sisteminin altına koyun. Kenar tespit yazılımını kullanarak halkanın çevresi boyunca üst, alt, sol ve sağ olmak üzere dört pozisyondan kalınlığını ölçün.

Tek eksenli çekme testi gerçekleştirmek için. Bir halka örneği iki ince tel tutucuya monte edin. Halka üzerine 5 mN yırtılma yükü uygulanana kadar tutucuları genişletin.

Ardından, kalınlık ölçümlerinden hesaplanan kesit alanını girin ve ölçüm uzunluğunu kaydedin. Halkayı, yırtılma yükü ile 50 kilo pascal arasında sekiz kez ön çevrime tabi tutun. Sekizinci ön çevrimden sonra, dakikada 10 milimetre hızla kopma gerçekleşene kadar gerilime tabi tutun.

Her bir halka için nihai çekme gerilmesini ve kopma gerinimini ölçün ve elde edilen verilerden maksimum tanjant modülünü hesaplayın. Fonksiyonel in vitro çalışmalara ek olarak, bu canlı hücre halkaları doku tüpleri oluşturmak için birleştirilebilir. Bevel kenarlar oluşturmak amacıyla silikon tüplerin uçlarını cerrahi makasla açılı şekilde kesin ve ardından silikon tüpleri otoklavlayın.

Bir Petri kabını besiyeri ile doldurun, sterilize edilmiş özel silikon tüp tutucuları bir biyogüvenlik kabinine aktarın ve boş bir Petri kabına yerleştirin. Ardından, halkaları aros kuyucuklarından çıkarın ve besiyeri ile doldurulmuş Petri kabına yerleştirin. Silikon tüpleri, kullanmadan önce ıslanmaları için aynı petri kabına yerleştirin.

Bir silikon tüpün ucunu bir halkanın merkezine yerleştirmek için pens kullanın ve halkayı silikon tüpün üzerine nazikçe kaydırın. Halkaları, tüp boyunca her iki yöne doğru sırayla nazikçe iterek birbirine temas edecek şekilde kaydırın. Halkalar monte edildikten sonra, silikon tüpleri polikarbonat tutucular içinde hizalayın ve tutucunun iki parçasını birbirine vidalayın.

Petri kabına 55 mililitre besiyeri ekleyin. Doku tüplerini uzaklaştırmak için kültür süresi boyunca besiyerini her üç günde bir değiştirin. İlk olarak, bir Petri kabını PBS ile doldurun.

Ardından silikon tüpleri polikarbonat tutucudan çıkarın ve doku tüplerini silikon tüpten kaydırarak kabın içine yerleştirmek için pens kullanın. Doğru şekilde gerçekleştirildiğinde, hücreler aros kuyucuklarının tabanına çöker ve yerleştikten sonraki 24 saat içinde kasılarak Agarro s kuyucuğundaki merkez direğin etrafında bir doku halkası oluşturur; bu, sıçan düz kas hücrelerinden üretilen iki milimetrelik bir doku halkasının tek eksenli çekme testinden elde edilen bir stres-gerinim eğrisinin temsili bir grafiğidir. Nihai çekme dayanımı, maksimum çekme modülü ve kopma gerinimi değerleri daha sonra farklı kültür parametreleri altında büyütülen doku halkası örneklerinin mekanik özelliklerini karşılaştırmak için kullanılır.

Hücre ekim sayısı, kültür süresi, kültür ortamı ve kullanılan hücre tipi dahil olmak üzere kültür parametreleri değiştirilerek doku halkalarının mekanik özellikleri kontrol edilebilir. Sıçan düz kas hücrelerine ek olarak, insan primer düz kas hücreleri de benzer çekme dayanımına sahip doku halkaları oluşturur.

İnsan mezenkimal kök hücreleri de halkalar oluşturacak şekilde kümelenir, ancak mekanik testler için yeterince güçlü değillerdi. Sistemimiz, hücreleri özel aros kuyucuklarımıza ekerek tamamen hücrelerden oluşan mühendislik ürünü doku konstrüktlerinin üretilmesine olanak tanır. İlk polikarbonat kalıp işlendikten sonra, kalıpları oluşturmak için kullanılabilecek sınırsız sayıda PDMS şablonu yapabiliriz, böylece ek bir ekipmana gerek kalmaz.

Sistem, doku halkaları oluşturmak için bir dizi farklı hücre tipini kullanmış olmamız nedeniyle çok yönlüdür ve bu nedenle bu sistem, hem doku mühendisliği uygulamaları hem de hücrelerin ve hücre dışı matrisin doku yapısı ve işlevine katkılarının in vitro çalışmaları için potansiyel olarak kullanılabilir.