Osmotik Kaçınma IN Caenorhabditis elegans: İki Genler Synaptic Fonksiyonu, İnsan Orthologues NRXN1 Ve NLGN1 olarak Adaylar

Merhaba, ben İspanya'daki Cordova Üniversitesi Genetik Bölümü'nden Manuel Ruiz Rubio. *C. elegans*'ın tamamen karakterize edilmiş sinir sisteminden faydalanarak, otizm çalışmalarında bu canlıyı deneysel bir araç olarak kullanıyoruz. Sinaptik bağlantılarda yer alan ve otizmle ilişkilendirilen genlerde kusurları olan nematod mutantlarını inceliyoruz.

Neureksinler ve nöroliginler, sinapslarda bulunan membran yapışma molekülleridir. C. elegans'ın baş kısmı, ozmotik kuvvet dahil olmak üzere farklı uyarılara verilen yanıtları yöneten bir nematod duyusal organı olan amfidi içerir. Amfid, silli dendritlere sahip 12 duyusal bipolar nöron ve bir presinaptik terminal aksonundan oluşur.

Bu nöronlardan ASHR ve ASHL olarak adlandırılan ikisi, yüksek osmotik güce sahip suda çözünür iticileri tespit ederek osmotik duyusal fonksiyonda özellikle önemli bir rol oynar. C. elegans'ın sinaps kusurlu mutantlarında osmotik kaçınmayı ölçmek için 4M fruktoz halkası yöntemini kullandık.

Neureksin ve nöroliginin yüksek ozmotik basınçtan kaçınmadaki etkilerini değerlendirmek için, 4M fruktoz çözeltisine dayalı bir yöntem kullanarak nrx-1 ve nlg-1 genlerinde defektli mutantların C. elegans'a karşı farklı yanıtlarını bildirdik. Uygulama gününde, %1 Kongo kırmızısı içeren 4M'lık bir fruktoz stok çözeltisi hazırlayın ve oda sıcaklığında tamamen çözünmesini sağlayın. NGM plakası üzerindeki katı besiyerinin merkezine, bir santimetre çapında halkasal bir ring çizin.

15 µL kırmızı 4M fruktoz çözeltisi kullanın. Fruktozun agar içerisine yaklaşık beş dakika boyunca nüfuz etmesini bekleyin; deney körleme yöntemiyle gerçekleştirilmelidir. Her suşun bulunduğu plaka, ikinci bir deneyci tarafından etiketlenmelidir.

SA, bu işaretlerin istenmediği şekilde gerçekleştirilir. Deney, satıştan yaklaşık 24 saat önce tamamlandığında, her genotipten dört adet L4 larvası seçmek ve bunları e coli bakterileri içeren bir AFL NGM plakasına aktarıp ertesi güne kadar 20 °C'de muhafaza etmek gerekir. Deneye genç yetişkinlerle başlanmalıdır.

Her suştan birer adet solucanı dinlenme dairesine yerleştirin ve her hayvanı, tik bariyerine verdiği yanıtı zamanlayarak takip edin. Kesin bir sonuç elde etmek için her suştan 10 hayvanla ve en az üç tekrarlı deney gerçekleştirilmelidir. Kırmızı halkadan art arda altı kez kaçınanlar normal olarak sınıflandırılır.

Altı denemeden daha kısa sürede halkadan çıkanlar, osmoz hassasiyetinde kusurlu olarak kabul edilir; her SA Bristol'de kontrol suşu kullanılmalı ve halka bariyerinden kaçındıkları için iki hayvan pozitif kontrol olarak kullanılmalıdır. Kontrol suşları, dört molar fruktozdan oluşan bir osmotik bariyerle karşılaştıklarında geri giderek tepki verirler. Nöronal eksikliği olan mutantlar, yüksek osmotik güç açısından buna benzer bir davranış sergilerler.

Bununla birlikte, NEUR eksik mutantları bu ozmotik bariyeri tespit edememiştir. Farklı aktif neur ve nout alellerine sahip çift mutantlar, ozmotik güce yanıt veren yabanıl tip fenotipini yeniden kazanmıştır. RNA interferans besleme yoluyla solucanların indirgenmesini sağlamak için, hedef gene karşılık gelen bir fragman içeren L 44 40 vektörü ile transforme edilmiş E. coli HD 115 suşu kolonileri izole edilir. Bakteriler, ertesi gün karbonatlı LBA veya plak üzerine izole edilir.

Bir bakteri kolonisi seçin ve LV sıvı besiyerine inoküle edin. 37 °C'de çalkalamalı inkübatörde yaklaşık yedi saat boyunca büyümeye bırakın. Bu kültürden bir damlayı, karbonik tavan ve IPTG içeren NGM plakasına damlatın ve bakterilerin büyümesine ve hedef gen fragmanının ekspresyon indüksiyonunun başlamasına izin vermek için oda sıcaklığında gece boyunca bekletin.

RNA interferansı için pozitif ve negatif bir kontrol kullanılması gereklidir. Besleme deneyleri. Negatif kontrol eşittir.

TL 44 40 vektörü ile transforme edilmiş HT 11 five suşları. Pozitif kontroller, 22 gen dizisini içeren L 44 40 vektörü ile transforme edilmiş ELI HT 11 five hücreleridir. Bu genin nakavtı, steril mikroskop altında kolayca ayırt edilebilen sarsıntılı bir fenotip oluşturur.

Birinci Gün. Bakterili NGM PLA'dan dört adet L4 evresindeki canlı, bakterili plaklara aktarılır ve 12 saat boyunca 20 °C'de bekletilir. Bu bir açlık dönemidir.

Ertesi gün, hızlı büyüyen genç yetişkinleri, spesifik RNA interferans hedef genini eksprese eden bakterilerle ekilmiş plakaya taşıyın. F1 neslini elde etmek için 20 °C'de yaklaşık 48 saat bekletin. Ardından, sonraki iki gün boyunca birkaç F1 yetişkinini aynı bakterilerle ekilmiş başka bir plakaya seçip aktarın.

F2 progeny içerisinden genç yetişkinleri seçin ve izole edin. Fenotipler için Bristol N2 vahşi tip suşunun bakterilerle beslendiği ortamda değerlendirme yapın. L44 40 vektörü, ozmotik bariyer üzerinden geri giderken kullanılmıştır.

C. elegans'tan neur geninin bir fragmanını eksprese eden bakterilerle beslenen Bristol ve true white tip suşları, 4M molar çözeltileri tespit edememiştir. Bununla birlikte, osmotik bariyeri tespit edemeyen neur eksik mutantlar, C. elegans'tan nlg-1 geninin bir fragmanını eksprese eden bakterilerle beslendiklerinde bu kapasiteyi geri kazanmışlardır. Bu videoda, C. elegans'ta osmotik kaçınma yanıtını etkileyen genlerin etkisini incelemeye olanak tanıyan basit bir yöntemi gösteriyoruz.

Osmotik güce karşı verilen yanıtı analiz etmek için Kongo Kırmızısı ile beraber fruktoz formal halkası kullanılır. Neuroligin eksikliği olan mutantlar bu yanıtta kusurludur; ancak, NU mutantlarının ozmotik stresi algılama yetenekleri bozulmamıştır ve yabani tip suşa benzer bir yanıt göstermektedirler. Bu video, nrx ve nlg genlerinde farklı aktif nakavt allelleri taşıyan çift mutant suşların, osmotik güce yanıt veren yabani tip fenotipini geri kazandığını göstermektedir.

Bu gözlemler, besleme yöntemiyle RNA interferansı kullanılarak doğrulanmıştır. Bu sayede, ilgili ING geni dizisini eksprese eden bakterilerle beslendiğinde, yaban tipi suşun osmotik bariyeri tanıma yeteneği bozulmuştur. Öte yandan, 4M fruktoz çözeltisini tespit edemeyen nlg defektif mutantlar, ilgili NNU geni dizisini eksprese eden bakterilerle beslendiklerinde bu davranışı geri kazanmışlardır.

Bu deneyde gösterilen sonuçlar, nrx-1 ve nlg-1'in nematodun duyusal nöronlarının sinaptik bağlantılarında rol oynayabileceğini ve ayrıca sinaptik fonksiyonu etkileyecek şekilde birbirleriyle etkileşime girdiklerini göstermektedir. Tamam, hoşça kalın ve deneylerinizde başarılar dilerim.