Gerilim duyarlı Boyalar kullanarak Gine domuzu Enterik Ağları Elektrik Faaliyet Optik Kayıt

Bu video, voltaj duyarlı boya D-4-A-N-E-P-P-D-H-Q kullanılarak elektriksel olarak stimüle edilmiş enterik sinir sistemi preparatlarının diseksiyonunu ve ardından görüntülenmesini göstermektedir. Ötanize edilmiş bir guinea pigden bağırsak segmenti alınır ve optik kayıtlar için önce submukozayı ve nihayetinde miyenterik pleksusu açığa çıkaracak şekilde diseke edilir. Başlangıçta yüksek çözünürlüklü bir görüntü alındıktan sonra, D-4-A-N-E-P-P-D-H-Q ile boyanmış ve monte edilmiş doku üzerine elektrotlar yerleştirilir.

Elektriksel aktiviteyi belirten optik değişiklikler, yüksek hızlı kamera ile kaydedilir. Yüksek hızlı çekim sırasında elektriksel stimülasyon uygulanır. Daha sonra, yüksek çözünürlüklü görüntü, neuro plex kullanılarak analiz edilmek üzere yüksek hızlı kameranın piksel haritası üzerine bindirilir.

Merhaba, ben Brian Salzberg; Pennsylvania Üniversitesi Nörobilim Bölümü'nde bulunan Hücresel Optik Laboratuvarı'nın (veya bizim deyimimizle loco'nun) direktörüyüm. Benim adım Analia Obide. Ben de Hücresel Optik Laboratuvarı'nın bir üyesiyim.

Bugün size, voltaj duyarlı boyalar kullanarak sağlam memeli nöronal ağlarından elektriksel aktivite kaydetme prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü, ikinci beyin veya bağırsak beyni olarak da adlandırılan enterik sinir sistemini oluşturan iki ağ içindeki ve arasındaki nöronal bağlantısallığı incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

İzofluran inhalasyonu ile anestezi uygulanmış ve kafası kesilmiş, 150 ila 200 gram ağırlığında veya iki ila üç haftalık bir Hartley Gine domuzunun ince bağırsağını çıkararak submukozal ve enterik pleksus preparatlarını hazırlamaya başlayın. Ardından, lümeni sıcak, oksijenlendirilmiş M1 99 DM solüsyonu ile yıkayarak bağırsağın içeriğini temizleyin. Polariteyi koruduğunuzdan emin olarak sekiz ila 10 santimetre uzunluğunda bir bağırsak segmenti kesin.

Örneği, oda sıcaklığındaki M1 99 DM içeren, sard kaplı 10 santimetrelik bir cam kaba aktarın. Kabı karanlık alan aydınlatmalı bir diseksiyon mikroskobuna yerleştirin. Ardından makas kullanarak mezenterik kenarı açın ve bağırsak segmentini mukoza tarafı yukarı bakacak şekilde sabitlemek için entomolojik iğneler kullanın.

Dumont düz uçlu ince pensleri yaklaşık yatay bir konumda tutarak, dokunun iğnelendikten sonra dikdörtgen bir şekil alması ve mukozal villus sıralarının düzenli olarak hizalanması için gerginliğin eşit şekilde korunması son derece önemlidir. Bağırsak segmentinin bir ucundaki villusları yakalayıp dokunun uzunlamasına ekseni boyunca çekerek mukozayı soyun. Submukoza ganglionlarını ve submukozal damarlanmayı içeren submukozayı açığa çıkarmak için mukoza şeritlerini ayırmaya devam edin.

Ardından, çok ince makaslar kullanarak sirküler kas liflerinin yönünü takip edecek şekilde submukozal tabakada bir kesi yapın. Daha sonra, sirküler kas tabakasını makasla aşağı iterek submukozayı ince pensle çok nazikçe kaldırın ve uzunlamasına kenarlar boyunca kesin.

Ayırma işlemi ilerledikçe submukozayı preparatın geri kalanından serbest bırakın. Şimdi, submukozal preparatın nihai boyutunu belirlemek için, ilk kesiğin 1,5 ila 3 cm uzağında dairesel kas liflerinin yönünü takip eden ikinci bir kesi yapın; elde edilen submukozal segment 30 ila 50 µm kalınlığında olup örümcek ağı benzeri bir görünüm sergiler. Bunu taze M1 99 DM içeren başka bir syl guard kaba aktarın ve nazikçe, gerginlik oluşturmadan iğneleyin.

Ardından, kabı daha sonra kullanmak üzere oda sıcaklığında oksijenli bir hazneye yerleştirin. Orijinal bağırsak segmenti şu an mukoza ve submukozadan arındırılmış olmalı ve sirküler kas açığa çıkmış olmalıdır. Bu segment, miyenterik pleksusu açığa çıkarmak için bir miyenterik pleksus preparatı elde etmek amacıyla kullanılır.

Hazırlığın her iki yanındaki fiber demetlerini düz uçlu ince pensle çekerek dairesel kas tabakasını mümkün olduğunca temizleyin. Açığa çıkan miyenterik pleksus, boylamsal kas tabakasından ve altındaki CI'dan ayrılamaz. Miyenterik pleksus hazırlığını, oksijenlendirilmiş M1 99 M içeren yeni bir sard kaplı kaba aktarın. Ardından, canlı kas içeren örneği gevşekçe iğneleyin. Optik deneyden birkaç dakika önce, hazırlığı kas kasılmasını önlemek için iki mikromolar nefe içeren M1 99 DM ile doldurulmuş yeni, daha küçük bir syl guard kaplı kaba aktarın ve çevresine birden fazla çok ince iğneyi dikkatlice yerleştirerek güvenli bir şekilde sabitleyin.

Gerilimin eşit şekilde dağıldığından ve dokunun sil koruyucu tabana tamamen düz bir şekilde yerleştiğinden emin olun. Doku preparatı artık fizyolojik deneyler için hazırdır. Cam bir vial içerisinde, M1 99 M çözeltisinde iki micromolar nifedipine ile birlikte, mililitre başına beş ila 50 microgram DAI four A-N-E-P-P-D HQ içeren bir stok çözelti hazırlayın ve vialin üzerini alüminyum folyo ile kapatın.

Stok çözeltiden gelen etanolün miktarı, hazırlığı kapsayan Nifedipinli M1 99 DM çözeltisinin %0.5'inden az olmalıdır; bu çözeltiyi hazırlanan boya çözeltisiyle değiştirin. Dokuyu tamamen örtecek kadar ladder hacmi kullanarak, inkübasyonun ardından oda sıcaklığında 10 ila 30 dakika inkübe edin. Hazırlığı, odacığın tüm içeriğini değiştirerek oksijenle zenginleştirilmiş M1 99 M artı NEFE ile yıkayın.

Elektriksel olarak stimüle edilmiş preparasyonlarda nöronal aktivitenin optik kaydı; bir görüntü ayırıcı ile donatılmış dik epi-floresan mikroskop, düşük çözünürlüklü hassas yüksek hızlı bir kamera, yüksek çözünürlüklü siyah beyaz bir kamera, bilgisayar kontrollü bir stimülatör ve bir mikromanipülatörden oluşan bir sistem kullanılarak gerçekleştirilir. Tüm düzenek, hava yoluyla gelen titreşimleri en aza indirmek için ağır akustik perdeler ve bir Mylar tavanla çevrelenmiş, aktif titreşim izolasyon tablası üzerine monte edilmiştir. Her iki kameradan görüntü alımı, hem neuro plex hem de Global Lab image two veya başka bir görüntüleme yazılımını çalıştıran tek bir bilgisayar üzerinden gerçekleştirilebilse de, burada gösterilen kurulum optik deneylere başlamak için her biri ayrı bir kamerayı kontrol eden iki bilgisayar kullanmaktadır.

Boyanmış örnek haznesini mikroskop tablasına yerleştirin. D four A ve EPPD HQ, yalnızca lipid ortamındayken floresan veren membran geçirgen olmayan boyalar olduğundan, boyanmış enterik preparattaki sağlıklı nöronlar, 20 x üzerindeki herhangi bir büyütmede incelendiğinde boş balon görünümünde olmalıdır. Eksitasyon için HQ 5 35 50, emisyon için HQ 5 72 LP four ve 5 65 nanometre dikroik ayna filtrelerini kullanın.

Ardından, mikromanipülatör kontrollerini kullanarak, çok kanallı lineer matris dizi elektrodu dokunun oral ucuna konumlandırın ve elektrodun mikroskop objektifine çarpmadığından emin olun. Bir santimetrelik bir açıklığa yayılmış 10 tungsten elektrot içeren lineer bir matris dizi, birkaç bağımsız nöronal yolu uyarmaya kapasitelidir ve birbirine bağlı ganglionik devrelerin incelenmesi için oldukça uygundur. Bununla birlikte, temsili veriler için ev yapımı iki uçlu bir stimülasyon elektrodu kullandık.

Fonksiyonel kayıt yapmadan önce, yapışkan balmumu kullanarak odacığın karşı ucuna bir toprak elektrodu yerleştirin; görselleştirmeye yardımcı olması için elektriksel aktivitenin kaydedileceği bölgenin yüksek çözünürlüklü siyah beyaz bir görüntüsünü edinin. Floresans koyu görünecek şekilde gri tonlama tersine çevrilebilir. Bilgisayar kontrollü stimülasyon jeneratörünü kullanarak akım stimülasyonu uygulamak için, öncelikle uygun yoğunluk, süre, frekans ve stimülasyon sayısının yanı sıra optik veri toplama başlangıcına göre gecikme süresini seçerek cihazı programlayın.

Stimülasyonun optik veri toplama sınırları içerisinde gerçekleştiğinden emin olmak için, stimülasyon jeneratörünü neuro plex tarafından kontrol edilen bir cihaz olarak yapılandırın. Ardından, neuro plex içerisinde kare hızı, kare sayısı ve kamera kazancını belirterek toplama parametrelerini ayarlayın. Bir aksiyon potansiyelinin tam çözünürlüğünü elde etmek için kare hızı minimum bir kilohertz olarak ayarlanmalıdır.

D four A ve E-P-P-G-H-Q, depolarizasyon üzerine voltaj değişimiyle doğrusal olarak ilişkili bir floresans azalması sergilediğinden, aksiyon potansiyelleri ters görünmesin diye neuro plex içindeki optik sinyal ekranını tersine çevirin. Veri toplama işlemini başlatın. Her bir fonksiyonel kayıt işlemini gerçekleştirmeden önce, her bir görüş alanının yeni, yüksek çözünürlüklü siyah-beyaz görüntüsünü almayı unutmayın.

Kayıt tamamlandığında, sonuçları çevrimdışı olarak analiz etmek için neuro plex kullanın. Ekranın sayfa görüntüsü (page display) olarak adlandırılan alanı, 80'e 80 yüksek hızlı kamera tarafından tek bir kare olarak yakalanan preparatın ham görüntüsünü gösterir. Sayfa modu mutlak kare (absolute frame) olduğunda, neuro plex görüntüleme komutları kullanılarak ikinci kamera ile elde edilen yüksek çözünürlüklü görüntü, ham görüntünün piksel haritasının üzerine bindirilir.

Bu işlem, sayfa modunun mutlak izden izlere değiştirilmesini ve görüntüleme komutu içerisinden üst üste bindirilmiş görüntünün seçilmesini gerektirir. Sayfa ekranında gösterilen görüntüden tekil pikselleri veya piksel gruplarını seçmek için fareyi kullanın. Bu ilgi alanlarının çıktıları, iz görüntüleme penceresinde izler olarak görünecek ve söz konusu pikseller tarafından kaydedilen optik değişimlerin büyüklüklerini zamanın bir fonksiyonu olarak ortaya koyacaktır.

Yüksek çözünürlüklü görüntüdeki gri tonlamanın tersine çevrilmesi, izleme modu sayfa ekranındaki görselleştirmeyi iyileştirir ve stimülatörden analog bir çıkış görüntülenmesi şiddetle tavsiye edilir. İzleme görüntüleme penceresine dahil etmek için analog çıkış kanalını seçin. Bu çıkış, deney sırasında uygulanan stimülasyonların kesin zamanlamasını belirtir.

Verileri bir film olarak görüntülemek için, bir veri kümesi içindeki ardışık kareleri, floresan yoğunluğundaki maksimum ve minimum değişime göre ayarlanmış psödo renk ölçeklerini kullanarak görüntülemek amacıyla neuro plex içindeki film komutlarını kullanın. DIA four A-N-E-P-P-D-H-Q ile boyanmış bir miyenterik pleksus preparasyonundan alınan bir ganglion, yüksek çözünürlüklü kamera ve 60 x objektif ile görüntülenmiştir. Veri toplama sırasında, preparasyon 40 hertz hızında beşli bir puls dizisi ile stimüle edilmiştir.

Her bir impulsun genliği 15 milliamps ve süresi 0.5 milliseconds olacak şekilde, dört ilgi bölgesi veya ROI belirlenmiş ve seçilen bölgeler üzerinden ortalaması alınan optik verileri görüntülemek için izler oluşturulmuştur; yalancı renkli kare dizisinde, nöronal aktiviteye işaret eden membran depolarizasyonunun ilk optik yanıt bölgeleri sarıdan kırmızıya doğru görünmektedir. Bu veriler, stimülasyonla tetiklenen aktivitenin her ganglionun ayrı bölgelerinde meydana geldiğini ve çoğunlukla geçiş aksonları tarafından taşındığını göstermektedir. ROI iki, üç ve dört, ROI bir'den çeşitli mesafelerde bulunan bireysel nöronları tanımlamaktadır.

Şekil iki, 10 x büyütmede, bilginin yayılabileceği anatomik yolları göstermektedir; oklar, belirlenen miyenterik ganglionu aktive etmek için uyarının izlediği yönü belirtir. Az önce, voltaj duyarlı boyalarla elektriksel aktiviteyi kaydetmek için kullanılan bir optik düzeneğin bileşenlerini ve bu teknolojinin enterik sinir sistemine uygulandığında, mikroskop altında iki sağlam memeli ağı içindeki ve arasındaki fonksiyonel bağlantısallığın incelenmesi olasılığını nasıl açtığını gösterdik. Optik kayıt teknolojisi kullanılırken, detaylara dikkat etmek son derece önemlidir.

Optik, mekanik ve elektriksel gürültü kaynaklarının dikkatle kontrol edilmesi ve preparatın sağlığının titizlikle korunması gerekir. Bu nedenle, optik kayıt işlemlerinde başarıya ulaşmak için bu protokolün tüm bireysel adımlarında uzmanlaşmak esastır. İşte hepsi bu.

İzlediğiniz için çok teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.