Basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek bir molekül akışı germe tahlil uygulama boyunca DNA moleküllerinin taşıma eğitimi için

Bu prosedürün genel amacı, moleküllerin DNA boyunca taşınmasını incelemek için basit, sağlam ve yüksek verimli tek moleküllü bir akış germe testi oluşturmaktır. Bu, önce biyotin etiketli bir oligo'yu lambda-DNA'ya bağlayarak biyotin etiketli lambda-DNA'nın hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, tek adımlı bir reaksiyon protokolünü takip ederek Polietilen Glikol veya PEG işlevselleştirilmiş lameller hazırlamaktır.

Daha sonra, yüksek verimli bir akış hücresi, bir PEG işlevselleştirilmiş lamel ile giriş ve çıkış delikleri içeren bir polidimetilsiloksan veya PDMS levhası arasına önceden kesilmiş kanallara sahip çift taraflı bir bandın sıkıştırılmasıyla oluşturulur. Son adım, hızlandırılmış Toplam İç Yansıma Floresan veya TIRF görüntüleme kullanarak akış kanalındaki tek floresan moleküllerinin yörüngelerini izlemektir. Akış gerilmiş lambda-DNA boyunca yayılan tek moleküllerin yörüngelerini belirlemek için, ham floresan görüntülerini analiz etmek için güvenilir ve verimli bir özel tek parçacık izleme yazılımı kullanılır.

Bu tahlil konfigürasyonunun alternatiflere göre başlıca avantajları, lamel hazırlamanın güvenilirliği, daha yüksek verim kapasitesi, numune hazırlama için daha az uygulamalı süre ve daha akıcı denetimsiz veri analizidir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımda bir doktora sonrası olacak, Dr.Kan Xiong. Bu teste başlamadan önce, gerekli tüm reaktifleri protokol metninde açıklandığı gibi hazırlayın.

Mililitre lambda-DNA stoğu başına 0,5 miligramı 60 saniye boyunca 65 santigrat dereceye ısıtın ve hemen ıslak buza daldırın. 100 mikrolitre lambda-DNA solüsyonunu bir mikrosantrifüj tüpü içinde iki mikrolitre 10 mikromolar biotin etiketli oligo ile karıştırın. Karışımı 65 santigrat derecede 60 saniye ısıtın ve ardından yavaşça oda sıcaklığına soğutun.

Karışımı buzun üzerine yerleştirin. 11 mikrolitre T4 DNA ligaz reaksiyon tamponu ekleyin ve hafifçe karıştırın. Daha sonra 800 ünite T4 DNA ligazına eşdeğer iki mikrolitre ve hafifçe karıştırın.

Karışımı 16 santigrat derecede iki saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Nominal moleküler ağırlık sınırı 100 kilodalton olan santrifüj filtre tüpleri kullanarak ürünü saflaştırın. Bir numaralı sonikate, 10 dakika boyunca bir boyama kavanozu içinde% 95 etanol içinde yer alır ve ardından üç kez ultra saf su ile durulayın.

Boyama kavanozunu bir molar potasyum hidroksit ile doldurun, tekrar 10 dakika sonikat yapın ve ardından üç kez ultra saf su ile durulayın. Bu döngüyü iki kez tekrarlayın. Lamelleri temiz kuru nitrojen gazı akışı altında kurutun.

Beş dakika boyunca 900 militorr basınçta hava plazma işlemi yaparak lamelleri daha fazla temizleyin ve kurulayın. Lamelleri, oda sıcaklığında% 95 etanol içinde çözülmüş mililitre başına 50 mikrolitre 25 miligram silan-polietilen glikol-biyotin ile iki saat boyunca inkübe edin. Fazla polietilen glikolü ultra saf suyla yıkayın ve polietilen glikol kaplı lamelleri temiz kuru nitrojen gazı akışı altında kurutun.

CAD yazılımı kullanarak akış kanalları tasarlayın ve kanalları bir bant kesici kullanarak çift taraflı bir bant üzerinde kesin. Kanalların içindeki bant kalıntılarını çıkarın. PDMS levhaları yapmak için, bir karıştırıcı kullanarak 45 gram PDMS'yi beş gram çapraz bağ reaktifi ile iyice karıştırın.

Karışımı iki adet 100 milimetrelik Petri kabına dökün ve tüm hava kabarcıkları gidene kadar bulaşıkları yaklaşık 30 dakika bir vakum odasında bırakın. Bulaşıkları PDMS katılaşana kadar yaklaşık iki saat 80 derecelik bir fırında bırakın. Önceden kesilmiş kanallara sahip çift taraflı bandın boyutuna uyan bir PDMS levhası kesin.

Çift taraflı banttan bir koruma filmi soyun ve PDMS levhasının düz bir tarafına yapıştırın. 23 gauge iğneli bir biyopsi deliği zımbası kullanarak PDMS levhası üzerindeki çıkış ve giriş deliklerini delin. Diğer koruma filmini çift taraflı banttan soyun ve lamelin işlevsel yüzeyine yapıştırın.

Monte edilmiş akış hücresini bir mikroskop tablası ekine sabitleyin. Önceden gazı alınmış tüm reaktifleri, bir solenoid valfe bağlı bir Tygon borusu ve reaktiflerin geri akışını önleyecek bir PEEK borusuna bağlı başka bir borusu olan rezervuarlara yükleyin. Reaktiflerin akışı, bir komut dosyası programlama uygulaması tarafından kontrol edilen solenoid valfler tarafından kontrol edilir.

Boş tamponda akarak bir akış kanalını astarlayın. Diğer üç PEEK borusunu giriş deliklerine yerleştirin. Kanal içinde hava kabarcığı oluşumuna neden olmamaya dikkat edin.

Kısa bir PEEK hortumu olan bir Tygon hortumunu çıkış deliğinden bir numune kabına bağlayın. Mililitre Streptavidin çözeltisi başına 0.2 miligram akar ve beş dakika inkübe edilir. Ardından, bağlanmamış Streptavidin'i yıkamak için boş tamponda akıtın.

Mililitre sığır serum albümin çözeltisi başına bir miligram akış ve bir dakika inkübe edin. Daha sonra bağlanmamış sığır serum albüminini yıkamak için boş tamponda akıtın. 100 pikomolar biotin-lambda-DNA çözeltisi içinde akın ve 10 dakika inkübe edin.

Ardından, bağlanmamış lambda DNA'larını yıkamak için boş tamponda akıtın. PEG işlevselleştirilmiş lamel kalitesini kontrol etmek için, SYTOX Orange boyası gibi DNA boyama boyasını akıtın ve floresan görüntülemeyi başlatın. Lamelin kalitesi iyiyse, akış gerilmiş lambda-DNA'ların yoğunluğu yüksek olacaktır.

Ayrıca, neredeyse tamamen akan gerilmiş lambda DNA'larının görüntülerinde en yüksek sinyal-gürültü oranını elde etmek için TIRF açısını ayarlayın. Tek moleküllerin yörüngelerini izlemek için, yeni bir kanal içinde inkübasyonları başlatın, ardından bir şırınga pompası kullanarak nanomolar florofor etiketli molekülleri yeterince yüksek bir akış hızında birleştirin ve 100 Hertz kare hızında hızlandırılmış floresan görüntüleri toplayın. Tipik olarak bir görüş alanında 10.000 kare toplanır ve birden çok görüş alanından filmler toplanır.

Sonunda, DNA'ların hala akışın gerilebileceğini doğrulamak için DNA boyama boyasını tekrar akıtın. DNA boyunca yayılan tek moleküllerin yörüngelerini belirlemek için özel bir tek parçacık izleme yazılımı kullanılacaktır. Yazılım ilk olarak yüksek doğrulukta tek parçacıkların merkez konumlarını belirleyecektir.

Lamel yüzeyine yapışmış parçacıkları çıkarın ve ardından hızlandırılmış yörüngeler oluşturmak için parçacıkları farklı çerçevelerde bağlayın. Bu yörüngelerden, 1B difüzyon sabitleri tahmin edilecektir. Veri analizine başlamak için bir komut dosyası programlama uygulaması açın ve tek parçacık izleme yazılımının dizinine gidin.

largedataprocess3.m adlı bir komut dosyası açın. Tanımlanması gereken önemli bir parametre, tek partikül tespiti için eşik değerdir. En uygun eşik değerini belirlemek için determine_threshold_value çalıştırın.

m komut dosyası. Bu komut dosyası, eşik değerinin tek parçacık algılamasını nasıl etkilediğini görselleştirecektir. En uygun eşik değerini belirledikten sonra largedataprocess3'ü çalıştırın.

m komut dosyası. Tek parçacık izleme analizinin tamamlanmasından sonra, ham yörüngeler trajectory_filtering çalıştırılarak filtrelenecektir. m komut dosyası.

Filtreleme adımını görselleştirmek için bir Grafik Kullanıcı Arayüzü veya GUI oluşturulmuştur. GUI panelinde, DNA boyunca minimum yer değiştirmeyi (MinXDisp) iki piksele ayarlayın. DNA'ya enine maksimum yer değiştirmeyi MaxYDisp'i iki piksele ayarlayın.

En az kare sayısını (minFrames) 10 olarak ayarlayın. Üçlü, minTriplets'in en az durum sayısını 10 olarak ayarlayın. DNA boyunca minimum difüzyon sabitini sıfır olacak D_par ayarlayın.

DNA'ya enine maksimum tahmini difüzyon sabitini D_trans, saniyede 10 mega baz çifti karesine ayarlayın. En küçük istatistik parametresi olan Chi2 Stat'ı eksi beş olarak ayarlayın. DNA boyunca yer değiştirmenin DNA'ya enine olan minimum oranını, MinX/Y'yi ikiye ayarlayın.

Bu filtreleme parametrelerini geçen tüm ham yörüngeler tablo birde, geçmeyenler ise tablo üç'te listelenecektir. Birinci tablodaki bir yörünge numarasına tıklayın. Yörünge birinci ve ikinci grafiklerde gösterilecektir.

Ham floresan görüntüleri oynatmak için oynat düğmesine tıklayın. Bu yörünge tek moleküllü bir kayma yörüngesi ise tablo2'ye ekle'ye tıklayın. Sonunda, GUI kapatılırken table2'ye eklenen tüm yörüngeler kaydedilecektir.

Tüm filtreleme adımlarını geçen yörüngeler, ortalama difüzyon sabitinin tahmin edileceği bir araya getirilir. Ortalama difüzyon sabitlerini hesaplamak için, komut dosyasını calculate_mean_diffusion_constant.m. çalıştırmanız yeterlidir. Bu prosedür, in vitro tek molekül biyofiziği okuyan birçok kişiye fayda sağlayacaktır.