Bitkisel Dokular Gen İfade Araştırmalar Robotik ve Dinamik Görüntü Analizi

Bu prosedürde, bitki dokularındaki gen ekspresyon dinamiği robotik sistemler kullanılarak zaman içinde görüntülenmektedir; ilk olarak bakla tohumları sterilize edilir ve çimlendirme için bir doku kültürü kabı içerisinde nemlendirilmiş kağıt havlular arasına yerleştirilir. Dört gün sonra, kotiledonlar çıkarılır ve GFP ile birleştirilmiş bir promotör içeren DNA konstrüktü ile bombarde edilerek Petri kaplarına yerleştirilir. Bu kaplar, iki boyutlu, özel tasarlanmış bir robotik görüntü toplama sistemine monte edilir. Robot, her bir doku parçasının görüntüsünü 100 saat boyunca her saat başı yakalayacak şekilde programlanır.

Görüntüler, GFP ekspresyonunun zaman içindeki yoğunluğuna ilişkin kantitatif veriler elde etmek amacıyla görüntü analizine tabi tutulur. Merhaba, ben John Finer, Ohio State Üniversitesi Bahçecilik ve Ürün Bilimleri Bölümü'ndeki Bitki Transformasyon Laboratuvarı'nın direktörüyüm. Ben de Ohio State Üniversitesi'ndeki ilgili laboratuvarda doktora öğrencisi olan Carlos Herandez Garcia.

Bugün Carlos, yeşil floresan protein kullanarak gen ekspresyonunun ve bitki dokularının analizi için geliştirdiğimiz protokolü size gösterecek. OD aktivitesinin stres düzeyini ölçmek için laboratuvarımızda geliştirdiğimiz bu prosedürü kullanıyoruz. Bunu yapmak için, raporlayıcı genimiz olan GFP geninin hemen ön kısmına (upstream) bu promotörü yerleştiriyoruz.

Promotör kontrolünün Lima fasulyesi kütlelerine nasıl tanıtıldığını ve özel tasarım robotik görüntü yakalama sistemimizde bir uygulamayı nasıl gönderdiğimizi göstereceğim. Görüntü analizi protokolümüzü gözden geçirerek sunumumu tamamlayacağım. Öyleyse, bu prosedüre standart yöntemleri kullanarak yüzey sterilizasyonu yapılmış Lima fasulyesi tohumları ile başlayalım.

Sterilize edilmiş tohumları, nemli kağıt havlu katmanları arasına gelecek şekilde magenta GA yedi kaplarına yerleştirin ve 25 °C'de dört gün boyunca inkübe edin. Burada, promotör ve promotör elementi analizleri için yararlı olan yüksek kopya sayılı bir ekspresyon vektörü kullanıyoruz. Bu vektör, bombardımandan yaklaşık bir ila iki saat önce transforme edilmiş dokularda promotör veya promotör elementi fonksiyonunu görselleştirmek için kullanılan GFP genini içermektedir.

Lima fasulyesi CU leadin kısımlarını tohum kabuklarından çıkarın. Bombardiman için uygun olan CU leadin kısımları, eksize edildikten hemen sonra sarıdan açık yeşile kadar renkli, düz ve sonraki görüntü analizlerini etkileyebilecek herhangi bir hasardan ari olmalıdır; 12 adet cu leadin'i MS tuzları B beş vitamin, %3 sükroz ve pH 5.7'de %0.2 jel oranına sahip OMS kültür ortamı içeren bir Petri kabına yerleştirin. Ardından, DNA konstrüktünü M 10 tungsten partikülleri üzerine çöktürün. İlk olarak, kullanımdan hemen önce partikülleri steril su içerisinde 100 miligram/mililitre konsantrasyona ulaşacak şekilde yeniden süspande edin.

Ardından, 0,6 mililitrelik bir santrifüj tüpüne 25 µL partikül, mikrolitr başına 1 µg konsantrasyonunda 5 µL DNA, 25 µL 2,5 M kalsiyum klorür ve 10 µL 100 mM spermidin ekleyin. DNA hazırlığını buz üzerinde beş dakika inkübe edin, ardından partiküllerin üzerindeki çözeltiden 50 µL alıp atın. Tüpün dibinde kalan DNA kaplı partikülleri vorteksleyerek yeniden süspande edin.

Vortekslenmeden hemen sonra, iki µL Eloqua alın. Bu vorteksleme adımını tekrarlayın. Her Eloqua alımında, kaplanmış partiküller buz üzerinde tutulmalı ve 15 dakika içinde kullanılmalıdır.

DNA partiküllere kaplandıktan sonra, iki µL partikülü, bir filtre ekranının ortasındaki şırınga filtresinin üst kısmından yerleştirin. Ardından, şırınga filtresini partikül giriş tabancası veya PIG odasındaki filtre tutma ünitesine yerleştirin. Bir lima fasulyesini, aksiyel tarafı yukarı bakacak şekilde, bir beherin altına eritilerek sabitlenmiş bir ekrandan oluşan bir bölmeye yerleştirin.

Parçacık tabancası haznesinde, bombardıman sırasında dokuları desteklemek için platform olarak kullanılan saptırıcıyı yerleştirin. Dokuyu bombardımana tutmak için öncelikle hazneyi tahliye etmek amacıyla vakuma giden vanayı açın. Vakum 760 milimetre cıvaya ulaştığında, parçacıkları itmek için solenoidi etkinleştirin ve helyumu salın.

Parçacıkları hızlandırmak için kullanılan helyum basıncı 50 ile 60 PSI arasındadır. Parçacık bombardımanından sonra, vakum hattı valfini kapatın ve tahliye valfini kullanarak vakumu boşaltın. Vakum boşaltıldığında, bombardımana uğramış co leadin'i almak için hazne kapağını açın ve co leadin'i a dal tarafına geri yerleştirin.

Nicelleştirme ve ekspresyon profilleme için OMS kültür ortamına aktarın. Her bir DNA konstrüktü için en az üç örneği bombarde edin. İyi çalışılmış bir gen ekspresyon profili veren pozitif bir kontrol de dahil edilmiştir.

Ko-liderler artık görüntüleme için hazırdır. Cıva lambasını açın ve lambanın ısınması için 30 dakika bekleyin. SPOT R-T-C-C-D kamerasının ve sekiz plakayı tutan özel tasarım robotik platformun hareketini yöneten motor kontrolörünün güç kaynaklarını açın.

MZ L üç stereo mikroskobunda, 480 nanometre eksitasyon ve 510 nanometre emisyon değerlerine sahip GFP iki filtre setini seçerek GFP tespiti için filtre setini ayarlayın. Ardından, kalınlaştırılmış polikarbonat petri kabı kapaklarını %70 etanol sıkarak sterilize edin. Petri kabı tabanını örtmek için kullanılan bu özel kapaklar, görüntüleme sırasında yoğunlaşmayı önler.

Bombardımana tabi tutulmuş cuan içeren plakaları robotik platforma yerleştirin ve bunları sabitlemek için yan set vidasını sıkın. Şimdi, hem robotik platformu hem de görüntü alımını kontrol eden özel yazılım uygulamasını açın. Ayrıca yazılım üzerinden beyaz ışık kontrolör anahtarını açın ve platformu başlangıç konumuna yönlendirin.

Bu işlem, konumlandırmaya başlamadan önce gerçekleştirilir. Motor sekmesindeki her bir "coddle leadin" için ilk plakayı seçin. Platform, Petri kabının merkezini mikroskop objektifinin altına konumlandıracaktır.

Görüntü toplama için ilk CU LEADIN'i hareket mesafesi düğmelerini kullanarak hassas bir şekilde konumlandırın. Canlı mod özelliğini kullanarak cuddle leaden'ı uygun görüntüleme alanına taşıyın. İlk cuddle leaden için odağı ayarlamak amacıyla diseksiyon mikroskobundaki manuel düğmeleri kullanın ve büyütmeyi 1.6 x olarak ayarlayın. İlgi alanı belirlendikten sonra, bu konumu ekle düğmesine tıklayın.

Yazılım, bu bölgenin koordinatlarını bir konum çizelgesi dosyasına ekleyecek ve platform, plakalardaki geri kalan tüm coen'ler için plaka merkezine ayarlanmış konumlara geri dönecektir. Hareket mesafesi düğmelerini kullanarak, robotik platformdaki her plakanın altında bulunan üç manuel seviyeleme vidası ile aynı plaka üzerindeki geri kalan coan'lar için odak ayarını yapın. Tüm coan'ların koordinatları girildikten sonra, konum çizelgesi koordinatlarını kaydedin.

Eşlik eden yazılı protokolde açıklandığı üzere, GFP için mavi olan ışık tipi ve pozlama ayarı gibi görüntü toplama parametrelerini girin ve görüntülerin nereye kaydedileceğini belirtin. Yakalama zamanı kontrol sekmesine gidin; görüntü alma zaman aralığını ve toplam görüntü toplama döngü sayısını ayarlayın. Görüntüler tipik olarak 100 saat boyunca her saatte bir toplanır.

İyi tanımlanmış gen ekspresyon profillerinin oluşturulması. Pozisyon çizelgesi sekmesini açıp ardından çalıştırma çizelgesi düğmesine tıklayarak görüntüleme işlemini başlatın. 100 saatlik görüntü toplama işleminin sonunda, görüntü toplama sistemini dış ışıklardan izole edin.

Her biri yaklaşık beş megabayt olan yüksek çözünürlüklü görüntüler, görüntü analizi için hazırdır. Her klasördeki 100 ardışık görüntüyü birleştirmek için "image ready" özelliğini kullanın. Tüm ardışık görüntüleri kareler olarak içe aktarın ve görüntü işlemeyi hızlandırmak için bunları 800 x 600 piksel boyutuna yeniden boyutlandırın.

Ardından, tüm karelerde görünür olan yeni eklenmiş bir katman üzerinde işaretler ve görüntü referansındaki seçili GFP noktalarını kullanın. Hizalama tamamlandığında her bir görüntüyü manuel olarak hizalayın, referans olarak kullanılan katmanı silin ve dosyayı tek bir PSD dosyası olarak kaydedin. Ayrıca, tüm kareleri en yüksek çözünürlüğü kullanarak tek bir MOV dosyası olarak dışa aktarın.

Dosyalar artık GFP kantifikasyonuna başlamak için hazırdır. MOV dosyasını açmak için ImageJ kullanın ve 400 x 300 piksellik bir alan kırpın. Ardından, kırmızı ve yeşil kanallar için RGB split aracını kullanarak ardışık görüntüleri kırmızı, mavi ve yeşil kanallara ayırın.

Her bir kesit için ölçülen ROI'yi çıkarma (subtract measured ROI) eklenti aracını kullanarak arka plan floresansını çıkarın. Eşik değerlerini ayarlayarak ve piksel başına ortalama gri tonlamalı değeri ile toplam GFP ekspresyonu gösteren piksel sayısını ölçmek için tasarlanmış bir eklenti kullanarak GFP ekspresyonunu hesaplayın. Çıktı değerlerini ImageJ'den kopyalayın. Son olarak, yeşil ve kırmızı kanallar için çıktı değerlerini Microsoft Office'e yapıştırın.

Görüntü hizalama sonuçları hakkında fikir vermesi için verilerin daha fazla manipülasyonu amacıyla Excel kullanılmıştır. Bu ilk animasyon, 100 saatlik deney boyunca robotik platformun yeniden konumlandırılmasındaki tutarsızlığı göstermektedir. Nokta hareketi, manuel görüntü hizalamasından sonra robotik platformun her zaman noktasında tam olarak aynı konuma dönememesinden kaynaklanan bir artefakttır; GFP eksprese eden hücreler kolayca gözlemlenebilir ve bu takip sisteminin benzersiz özellikleri rahatlıkla görselleştirilebilir.

Bu animasyon tekrar ederken, daire içine alınmış GFP ekspres eden hücrelere dikkat edin; kırmızı daire içindeki hücre, bombardımandan sonraki 18 ila 20. saatlerde ekspresyonda çok hızlı bir düşüş gösterirken, beyaz daire içindeki hücre GFP ekspresyonunun gecikmiş bir başlangıcını göstermektedir. Animasyonların yanı sıra, bu prosedür lima fasulyesi hedef dokusundaki GFP ekspresyonunun zaman içindeki hızlı nicelendirilmesine olanak tanır. Bu temsili sonuçlar, CAMV 35 S promotörü ve dört farklı soya fasulyesi promotörü kullanılarak yapılan promotör yoğunluğunun karşılaştırmalı nicelendirmesini göstermektedir.

Çimlenmiş katalinlere DNA'nın nasıl aktarılacağını az önce gösterdik. Lima fasulyesi tohumları katalini robota yerleştirir, görüntü analizi için görüntüler toplar ve bu görüntüleri analiz eder. Laboratuvarımızda klon bitki promotörlerini doğrulamak için rutin olarak bu prosedürü kullanıyoruz.

Farklı bitki promotörlerinin tanıtılmasıyla çok miktarda veri elde edilebilir. Ancak, bu prosedür, hatalara açık birçok adım içeren karmaşık bir süreçtir; bu nedenle prosedüre taze fasulye tohumlarıyla başlamak veya en azından uygun şekilde saklanmış yüksek kaliteli tohumlar kullanmak önemlidir. Ayrıca, bombardıman için kesilen kapağı hızlıca alıp robota yerleştirmek ve yoğuşma sorunlarını en aza indirmek için kalın petri kabı kapağı kullanmak da önem taşımaktadır.

Son olarak, kullandığımız GFP'nin Harvard Üniversitesi'ndeki Gen HIN Lab tarafından geliştirilen SGFP adlı farklı bir versiyon olduğunu lütfen not edin. Bu GFP çok stabil değildir ve gen ekspresyonundaki hızlı değişimleri takip etmek için daha uygun olabilir. Bizimle izlediğiniz için teşekkürler.

Deneylerinizde başarılar dileriz.