Hücre Özgül Analizi

Bu prosedürün genel amacı, bir yapraktan hücre tipine özgü protoplast popülasyonu izole etmektir. Bu işlem, öncelikle yaprakta belirli hücre tiplerinde GFP eksprese eden bitkilerin yetiştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise yaprakların hasat edilmesi ve enzimatik sindirim kullanılarak protoplastların üretilmesidir.

Ardından, protoplastlar floresanla aktive edilmiş hücre ayıklama veya FACS kullanılarak filtrelenir ve ayrıştırılır. Son adım, ayıklamanın doğruluğunun floresan mikroskopi kullanılarak onaylanmasıdır. Nihayetinde, ayrıştırılan protoplastlar hücre tipine özgü gen ekspresyonu analizi, proteomik analiz veya metabolik profilleme için kullanılabilir.

Floresan aktivasyonlu hücre ayıklama yöntemi daha önce kökler için başarıyla kullanılmıştır, ancak burada yaprak hücrelerinin izole edilmesi için kullanılmıştır. Bu yöntemden önce GFP ile işaretleme yapılması, klorofil floresanından kaynaklanan girişim nedeniyle sınırlı kalmıştır. Hücre ayıklama sırasında meydana gelebilecek kapsamlı fizyolojik değişiklikleri minimize etmek için hızlı ancak dikkatli örnek hazırlığı kritik olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterimi büyük önem taşımaktadır.

Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, hücre ayırıcıyı nasıl kuracaklarını veya doğru ayrıştırmayı nasıl onaylayacaklarını bilmedikleri için zorluk yaşayacaklardır. Bu yöntem, bitki sistem biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Yaprak gibi karmaşık çok hücreli organlarda gen düzenleme ağlarını tanımlamanın önündeki sorun, farklı hücre tiplerinin farklı gen gruplarını eksprese etmesidir.

Bu genetik bilgi, tüm yaprağın hasat analizinde kaybolur. Prosedür gösterilmektedir. Laboratuvarımızdaki bu çalışma için teknik destek sağlayan Ellison As ve Sanjeev Kuma da bana eşlik edecekler. İlk olarak, dokuz santimetrelik yuvarlak bir Petri kabını, proto plaklama enzimleri ile transkripsiyonel ve RNA inhibitörlerini içeren 20 mililitre çözelti A ile doldurun.

Ardından, burada gösterilen örnek gibi tek bir yapraktan fazlasını içeren örnekler için istenen yaprak materyalini hasat edin. Yaprakları en fazla 15 yapraklık bir yığın halinde düzenleyin. Daha sonra, yaprakları bir milimetre genişliğinde şeritler halinde kesmek için bir jilet kullanın.

Yaprak şeritlerini düz cımbız kullanarak hemen Petri kabına aktarın, şeritleri nazikçe ayırın ve ardından numuneleri her seferinde beş dakika olmak üzere iki kez vakumlu infiltrasyona tabi tutun. Ardından, Petri kabını oda sıcaklığında 90 RPM'e ayarlanmış orbital sallayıcıya yerleştirin ve protoplast numunelerini üç ila dört saat boyunca bekletin. İnkübasyon sırasında, yarım saatlik aralıklarla cımbız kullanarak yaprak şeritlerini birbirinden ayırın.

Sindirimin ardından, protoplast çözeltisini 70 mikronluk bir hücre süzgeci aracılığıyla 50 mililitrelik bir tüpe nazikçe süzün. Yaprak şeritlerini uzaklaştırmak için şeritler süzgeçte tutulacak, protoplastlar ise süzgeçten geçecektir.

Şimdi, yaprak şeritlerini nazikçe durulamak için dört mililitre solüsyon A kullanın ve yıkama sıvısını 50 mililitrelik tüpte toplayın. Ardından protoplast süspansiyonunu yuvarlak tabanlı tüplere aktarın ve protoplastları oda sıcaklığında, 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Pellete zarar vermemeye dikkat ederek, süpernatantın mümkün olduğunca fazlasını nazikçe aspire edin ve ardından protoplastları aynı santrifüj koşulları altında beş mililitre solüsyon A ile yıkayın.

Son olarak, üstte yüzen katmanı uzaklaştırdıktan sonra, sıralama işleminden hemen önce PROTOPLASTLARI uygun hacimdeki çözelti A içinde yeniden süspande etmek için ucu kesilmiş bir P 1000 pipet ucu kullanın. Protoplast çözeltisindeki topaklanmaları dağıtmak için ucu kesilmemiş bir P 1000 pipet ucu kullanın. Protoplastları 50 mikronluk bir fillon filtre aracılığıyla bir toplama tüpüne filtreleyerek hücreleri daha fazla ayrıştırın.

Ardından, hücre kaynağı nozulunun tıkanmasını önlemek için hücre solüsyonunu uygun şekilde seyreltin. Optimal hücre kaynağı koşulları belirlendikten sonra, 580 30 bant geçiren filtreden gelen çıktıyı 530 40 bant geçiren filtre ile karşılaştırarak, 488 nanometre Argonne lazeri ile GFP pozitif protoplastları tanımlayın. GFP pozitif protoplastların, yüksek 530, düşük 580 popülasyonunda görüneceğini unutmayın.

Düşük 530, düşük 580 popülasyonundaki GFP içermeyen protoplastlar ile birlikte, ölü ve ölmekte olan protoplastlar ve döküntüler, sıralanmış protoplastların floresan mikroskobuyla görüntülenmesi için yüksek 580 popülasyonunda görülür; sıralama sonrası protoplastları doğrudan en az sekiz hacim Çözelti A içerisine sıralayın, ardından protoplastları santrifüjle yoğunlaştırın. Protoplastlar sekiz hacim Çözelti A içerisine sıralanabilir ve zenginleştirmenin doğrulanması için floresan mikroskobunda görüntüleme amacıyla toplanabilir. Bu ilk görüntü, bekçi hücrelerinde GFP ekspres eden TP 382 hücre hattının zenginleştirilmesine dair bir örneği göstermektedir. Bu yöntem kullanılarak amplifikasyon öncesi ve sonrası elde edilen verim örnekleri bu tabloda özetlenmiştir.

500 picogram ile 50 nanogram arasında elde edilen miktarlar, ovation PICO WTA sistemi ile amplifikasyon ve ardından kantitatif PCR, yeni nesil dizileme veya mikroarray ile analiz için yeterlidir. Bu sonraki görüntü serisi, az önce açıklanan yöntemle izole edilen ve ayrıştırılan çeşitli protoplast hücre hatlarını göstermektedir. Bu ilk protoplastlar KC 2 74'ten türetilmiştir; KC 2 74'ün yapraklarından alınan bir enine kesittir.

Yaprak, GFP'nin vasküler sistemde eksprese olduğunu göstermektedir. Bu protoplastlar KC 4 64 yapraklarından izole edilmiştir ve bir KC 4 64 yaprağının enine kesiti, GFP ekspresyonunun A dal epidermisinden tespit edildiğini göstermektedir. Son olarak, bu protoplastlar TP 3 82 yapraklarından türetilmiştir.

Burada GFP, bekçi hücrelerinde eksprese edilmektedir. 580 ± 30 nanometreye karşı 530 ± 40 nanometre bant geçiren filtrelerden elde edilen çıktıyı gösteren tipik FACS kazanım nokta grafikleri sunulmuştur. Gösterilen ayıklama kapıları, ayıklama sırasında tipik olarak kullanılanlardır.

İnhibitörlerin yokluğunda protoplastlara dönüştürülmüş coal four yaprağından türetilen protoplastların bu ilk nokta grafiği, tek bir düşük 530, düşük 580 popülasyonu göstermektedir. Buna karşın, inhibitörlerin varlığında protoplastlara dönüştürülmüş vahşi tip coal four yaprağından türetilen protoplastlara ait bu nokta grafiği, inhibitörlerin neden olduğu stres ve renklenmeye bağlı olarak 580 floresansında meydana gelen kaymayı göstermektedir. Bu nokta grafikleri sırasıyla KC seven four, KC 4 64 ve TP 3 82 hatlarından türetilen yaprak protoplastlarına aittir.

Bu örnekler ayrıca, GFP'nin yüksek 530 düşük 580 popülasyonlarında yer aldığını gösteren inhibitörlerin varlığında ön işleme tabi tutulmuştur. Bu temsilî kantitatif PCR deneyi için öncelikle her fraksiyon tipi için örnekler elde edilmiştir. Örnekler daha sonra ovation PICO WTA sistemi ve kantitatif PCR kullanılarak amplifiye edilmiştir.

GFP'ye özgü primerler kullanılarak işlem gerçekleştirildi. Gösterilen değerlerden en yüksekleri kırmızı ile, en düşükleri ise yeşil ile belirtilmiştir; actin two referans geni kullanılarak elde edilen ortalama veya tekil değerler yatay sarı çubuklarla gösterilmiştir. Sonuçlar, ayrıştırılmış fraksiyonlardaki GFP hücre içeriğinin optik değerlendirmelerinin yeniden doğrulanmasıdır.

Yüksek 530 düşük 580 popülasyonu, ölçülebilen en yüksek GFP ekspresyon seviyelerini sergilemiştir. Yüksek 530 yüksek 580 popülasyonu yaklaşık 1000 kat daha düşük GFP ekspresyonu sergilerken; düşük 530 düşük 580 ve düşük 530 yüksek 580 popülasyonları, kontrol tüm yaprak ve ayrıştırılmamış protoplast popülasyonlarınkilerle karşılaştırılabilir düzeyde düşük GFP ekspresyon seviyeleri göstermiştir. Bu teknikten uzmanlaşıldığında, uygun şekilde yürütülürse bitkiden ayrıştırılmış hücre popülasyonuna kadar olan süreç dört ila beş saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, ayrıştırma doğruluğunu korumak adına hücre ayırıcının sürekli izlenmesi ve gerektiğinde yeniden kalibre edilmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir.

Bu prosedür bulundu. Farklı hücre tiplerindeki gen ekspresyon seviyelerini karşılaştırmak ve farklılıklarını belirlemek için mikro-dizi analizi gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Bu teknik geliştirildiğine göre, artık farklı gelişim aşamalarındaki spesifik yaprak hücre tiplerinde gen ekspresyonunu analiz ediyoruz ve bunu agronomi projesinde üretilen tüm yaprağa ait verilerle karşılaştıracağız.

Bu videoyu izledikten sonra, floresanla aktive edilen hücre ayırma yöntemi kullanılarak yaprakların tekil hücre tiplerinin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.