Büyüme inhibisyonu fenotipleri tanımlanması Mayalarda bakteriyel Tip III Efektör İfade İndüklenmiş

Bu protokole başlamak için, tercih ettiğiniz bakteriyel efektörün ekspresyonu için bir vektör seçin. Maya ve maya suşu içerisinde, vektör daha sonra maya hücrelerine transforme edilir. Ardından efektörün ekspresyonu indüklenir.

Efektör ekspresyonunu doğrulamak amacıyla, indüklenmiş hücreler sonraki western blot analizi için lizlenir. Efektör ekspresyonu onaylandıktan sonra, hücreler büyütülür ve on katlık seri dilüsyonlar baskılayıcı ve indükleyici besiyerlerine damlatılır. Son olarak, iki ila üç gün sonra maya büyümesi analiz edilir.

Merhaba, ben Tel Aviv Üniversitesi Bitki Bilimleri Bölümü'nde Dr. Guido Cesa'nın laboratuvarından Do Solomon. Bugün size, mayada bakteriyel tip üç efektörlerinin ekspresyonu ile indüklenen büyüme inhibisyonu fenotiplerinin tanımlanmasına yönelik bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda gram-negatif patojenik bakterilerin tip üç efektörlerinin fonksiyonlarını incelemek için kullanıyoruz ve bu yöntem, efektör TIC hedeflerinin tanımlanmasında bize yardımcı olan bir araçtır.

Öyleyse başlayalım. İlgilenilen tip üç efektörlerin ekspresyonu için uygun bir maya sistemi tasarlanırken birkaç önemli faktör göz önünde bulundurulmalı ve optimize edilmelidir. Bunların ilki, efektörlerin ekspresyonunu yönlendiren promotördür.

Bakteriyel tip üç efektörleri maya hücreleri için toksik olabildiğinden, ekspresyonlarını kontrol etmek için indüklenebilir bir promoter kullanılmalıdır. Bu deneyde GAL1 promoterini kullanacağız. İkinci faktör ise efektör geninin kopya sayısıdır.

Efektör genin iki mikronluk bir plazmit tarafından taşındığı durumlarda yüksek ekspresyon seviyeleri elde edilir. Sentromer içeren bir plazmit kullanıldığında orta düzeyde ekspresyon sağlanır ve efektör gen homolog rekombinasyon yoluyla maya genomuna entegre edildiğinde düşük ekspresyon elde edilir. Dikkat edilmesi gereken üçüncü faktör ise, ilgilenilen efektöre karşı antikorların mevcut olmadığı durumlarda protein ekspresyonunu doğrulamak için kullanılan epitop etikettir.

Sık kullanılan etiketler, güvenilir ticari antikorların mevcut olduğu M hemaglutinin HA veya flag etiketleridir. Efektör proteinin yapı ve aktivitesi üzerindeki istenmeyen zararlı etkileri en aza indirmek için etiketin tek bir kopyasının kullanılmasını öneriyoruz. Son olarak, ekspresyon için kullanılacak maya suşunun, ekspresyon vektörünün seçilebilir markörüne tropik olması gerekir.

Transformasyon için maya hücreleri üretmek üzere, taze bir plakadan bir maya kolonisi seçin ve 15 mililitrelik bir polipropilen tüp içindeki üç mililitre YPD'ye inoküle ederek vorteksleyin. Kültür tüpünü kısa süreliğine bir roller cihazına yerleştirin ve 30 °C'de sabit rotasyonla gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah kültürü roller cihazından çıkarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 800 ×g'de santrifüjleyin.

Santrifüj işleminden sonra süpernatanı tamamen uzaklaştırın ve hücreleri bir mililitre Resus süspansiyon tamponunda, maksimum hızda yaklaşık 10 saniye boyunca vorteksleyerek yeniden süspanse edin. Transforme edilecek her bir plazmid ve ek bir kontrol transformasyonu için, hücre süspansiyonundan 100 mikrolitreyi bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Kontrol tüpü hariç her tüpe beş mikrolitre tek zincirli somon spermi DNA'sı ve 250 ila 500 nanogram plazmid DNA ekleyin.

Ardından, her tüpe dikkatlice 650 µL transformasyon çözeltisi ekleyin ve vorteksleyin. Tüpleri bir döner karıştırıcıda 30 °C'de 30 dakika inkübe edin. İnkübasyon tamamlandığında, hücrelerin parçalanmasını önlemek için her tüpe 70 µL DMSO ekleyin ve tüpleri 10 ila 15 kez alt üst ederek karıştırın.

Tüpleri vortekseleyiniz. Tüpleri 42 °C'ye önceden ısıtılmış bir su banyosuna yerleştiriniz ve 15 dakika inkübe ediniz. 15 dakika sonra tüpleri su banyosundan çıkarınız ve derhal iki dakika boyunca buz üzerinde bekletiniz.

Tüpler soğuduktan sonra, hücreleri santrifüj ile hasat edin ve ardından viskoz süpernatanı dikkatlice uzaklaştırmak için bir pipet kullanın. Her bir peleti 150 µL steril çift distile su içinde yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu uygun seçici besiyeri bulunan bir plakaya yayın. Plakaları iki dakika boyunca açık bırakın ve laminar akışlı kabinde kurumalarını sağlayın.

Ardından, maya hücrelerini büyütmek için plakları iki ila üç gün boyunca 30 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Protein ekstraktı hazırlamak için, taze bir plaktaki maya kolonisini üç mL uygun baskılayıcı ortama inoküle edin ve vorteksleyin. Ertesi gün, kültür tüpünü kısaca 30 °C'de bir rotatöre yerleştirin.

Kültürü rollerdan çıkarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 800 Gs ile santrifüjleyin, süpernatantı atın ve hücre peletini yeniden süspanse edin. Vorteksle karıştırılmış üç mililitre steril DDW içerisinde tekrar santrifüjleyin, süpernatantı atın ve hücreleri üç mililitre steril DDW içinde yeniden süspanse edin. Şimdi, hücre süspansiyonundan 200 mikrolitreyi, vorteksle karıştırılmış üç mililitre uygun indüksiyon besiyeri içeren yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın.

Tüpü bir roller'a yerleştirin ve gece boyunca 30 °C'de inkübe edin. Ertesi sabah, kültürden bir mililitre veya düşük yoğunluklu kültürler için daha fazla miktarda örneği bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 G'de santrifüj ederek hasat edin; bundan sonraki işlemleri, toksik Beamer capto etanol buharlarını solumamak için bir çeker ocak altında gerçekleştirin.

Süpernatantı bir pipet yardımıyla dikkatlice uzaklaştırın ve hücre peletini 100 µL buz gibi soğuk lizis çözeltisi içinde yeniden süspande edin. Vorteksleyerek güçlü bir şekilde karıştırın ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. 30 dakikalık inkübasyon sırasında, 100 µL lizis tamponunun pH değerini 9'dan 10'a titretmek için gerekli olan normal hidroklorik asit hacmini belirleyin.

Bunu yapmak için, 10 farklı tüpe bulunan 100 microliters lizis tamponuna çeşitli hacimlerde hidroklorik asit ekleyin ve uygun hidroklorik asit hacmindeki lizata inkübasyon sonunda bir pH indikatör şeridi kullanarak çözeltinin pH'ını kontrol edip vorteksleyerek karıştırın. Ardından, lizata 50 microliters üç katlı örnek tamponu ekleyip vorteksleyerek karıştırın, mikro santrifüj tüpünün kapağına bir iğne ile delik açın ve lizat çözeltisini ısıtma bloğunda beş dakika boyunca kaynatın. Kaynatma işleminden sonra, çözeltinin oda sıcaklığında iki dakika boyunca soğumasını bekleyin.

Ardından lizat çözeltisini vorteksleyin ve 10 saniye boyunca santrifüjleyin. Lizat, hücreleri spotting deneyi için hazırlamak üzere immüno kan analizine hazırdır. Ertesi gün, her suşun üç mililitrelik kültürlerini daha önce gösterildiği şekilde büyütün.

Lösin içermeyen sentetik komple besiyeri içeren iki plak hazırlayın. Plaklardan birinin besiyeri %2 glikoz ile, diğerininki ise %2 laktoz ve %1 rafinoz ile desteklenmelidir. Plakları steril bir laminar akış kabininde, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca kurutun.

Hücreleri hasat edin ve her bir hücre peletini üç mililitre steril DDW içinde yeniden süspande edin. Santrifüj adımını tekrarlayın ve hücreleri tekrar üç mililitre steril DDW içinde yeniden süspande edin. Her bir kültürün optik yoğunluğunu veya OD değerini belirleyin ve ardından steril mikrofij tüplerde OD 600 değeri bir olan bir mililitrelik hücre süspansiyonları hazırlayın.

Ardından, 900 mikrolitre steril DDW ile doldurulmuş üç steril mikro tüp kullanarak, her bir hücre süspansiyonundan on katlık üç seri dilüsyon hazırlayın. Kuru plakaları bir ızgara üzerine yerleştirin ve her bir kültür noktası için, yan yana dört dilüsyondan 10 mikrolitre damlatın. Damlatma işleminden sonra, plakaları birkaç dakika boyunca çeker ocakta açık bırakın.

Benekler kuruduğunda, plakların kapağını kapatın ve iki ila üç gün boyunca 30 derece Celsius'luk bir inkübatöre yerleştirin. Şimdi, büyüme inhibisyonunun tespiti için gerçekleştirilen bir maya benekleme analizinin sonuçlarını göstereceğiz. Buradaki fenotipler, bakterinin tip üç efektörleri olan A-V-R-P-T-O hop, AA one one ve AAV RE one'in ekspresyonu ile indüklenmiştir.

Domates patojenimiz Pseudomonas Riner'in yolakları, baskılayıcı ortamdaki bir maya suşunda, sentromer içeren bir plazmit üzerinden eksprese edildi; A-V-R-P-T-O ve HOP AA one one ekspresyonu için plazmit taşıyan maya suşları, boş vektör içeren kontrol suşuyla benzer büyüme sergiledi. AAV RE one taşıyan mayalar, muhtemelen GAL one promotörünün sızıntısı ve AV RE one'ın yüksek sitotoksisitesi nedeniyle hafifçe azalmış bir büyüme gösterirken, indüksiyon koşulları altında AV E one veya HOP AA one one'dan herhangi birinin ekspresyonu, tüm dilüsyonlarda koloni oluşumunun olmamasıyla kendini gösteren drastik bir büyüme inhibisyonu fenotipine neden oldu. Buna karşılık, A-V-R-P-T-O ekspresyonu herhangi bir büyüme inhibitör etkisi göstermedi.

Bakteriyel tip üç efektörlerinin mayadaki ekspresyonunun neden olduğu büyüme inhibisyonu fenotiplerinin nasıl belirleneceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, her ikisi de sonuçları önemli ölçüde etkileyebileceği için ekspresyon vektörünü ve suşu dikkatle seçmeyi unutmamak önemlidir. Ayrıca, prosedürün tüm adımlarında taze olarak transform edilmiş bu kolonileri kullanmayı unutmayın.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.