Bitki Polizom Profiling için bir Kolay Yöntem

Merhaba, ben Cecile. Marsilya'daki LGBP'de çalışıyorum. Bu videoda anlatacağımız protokol, aktif olarak çevrilen mRNA'ları tanımlamak ve translasyon regülasyonunu incelemek için çeşitli bitki dokularından polizomları ve monozomları izole etmek için basit bir yöntemdir.

Örnek olarak, size altı günlük Arabidopsis thaliana fidelerinden polizomların izolasyonunu, ardından RNA'nın izolasyonunu ve sonuçların analizini göstereceğiz. Tohumları tabağa ekin ve iki gün dört derecede bırakın. Daha sonra bitkileri altı gün boyunca büyütün.

Fideyi hasat edin ve sıvı nitrojen içinde öğütün. Ağırlık 300 miligram bitki tozu ve 2.4 mililitre polizom tamponu ekleyin. Bitki parçalarını toplamak için santrifüjleyin ve süpernatanı bir sükroz gradyanının üstüne yükleyin.

Ultra santrifüj gradyanı daha sonra OD'nin sürekli okunması ile aşağıdan yukarıya doğru toplayın. Fraksiyonu bir polizoma, bir monozoma ve bir süpernatant fraksiyona çekin ve RNA'yı gece boyunca çökeltin. Ultra santrifüj, peleti yeniden süspanse edin ve sonraki analiz için RNA'yı çıkarın. Polizom profillemesi yapmadan birkaç gün önce sükroz gradyanını hazırlayın.

% 50, 35 ve% 20 sükroz çözeltisi hazırlayın ve dört derecede tutun. % 50 sükroz tabakasını dökün. Eksi 40 derecelik bir dondurucuda dondurun.

Altı saat sonra, %35'lik katmanı ekleyin ve gece boyunca eksi 40 derecelik bir dondurucuda dondurun. İlk% 20'lik katmanı dökün ve dondurun. Deney günü, gerekli sayıda gradyanı dondurucudan çıkarın.

Son %20'lik sükroz katmanını ekleyin ve gradyanların soğuk bir odada çözülmesine izin verin. Taze topladığımız bitkinin örneğini hazırlayın. Burada Arabidopsis thaliana'nın altı günlük fidelerini kullanıyoruz.

Sıvı nitrojen donmuş bitkileri hasat edin ve iyice öğütün. Ağırlık: 300 miligram bitki tozu. Hızlı bir şekilde 2,4 mililitre taze polizom tamponu ekleyin ve homojenize edin.

Çözeltiyi iki adet 1,5 mililitrelik tüpe pipetleyin. Sitozolik ekstraktı santrifüjleyin. Süpernatanı pipetleyin.

Bitki parçalarından kaçınmaya dikkat edin. Bir sonraki adımda profili bozarlardı. Süpernatanı, gradyanı bozmadan sükroz gradyanına yükleyin.

Gradyanı bir SW 41 rotor kovasına koyun. Merkezkaç. Polizom profilini görselleştirmek ve fraksiyonu toplamak için, gradyana dalan bir kılcal borudan yapılmış basit bir sistem kullanıyoruz. Bir UV küveti ile bağlantılıdır.

Peristaltik bir pompaya kendi kendine bağlanır. Bir UV spektrofotometresi, gradyan küvet boyunca ilerledikçe OD'yi sürekli olarak kaydeder. Fraksiyon toplayıcı, iki mililitrelik fraksiyonun toplanmasına izin verir.

Küveti temizleyin ve spektrofotometreye yerleştirin. Degradeyi rahatsız etmeden kovadan çıkarın. Klorofiller gradyanın üstünde yoğunlaşmalıdır.

Kılcal boruları gradyanın altına daldırın. Peristaltik pompayı çalıştırın. Degrade aşağıdan yukarıya doğru toplanır ve OD sürekli okunur.

İki mililitrelik fraksiyonlar toplanır. İşte klasik bir profilin şekli. RNA çökeltmesi, guanidinyum hidroklorür ve izopropanol kullanılarak gerçekleştirilir.

İlk önce, 50 mililitrelik bir tüpe bir hacim guanidinyum hidroklorür dökün ve ardından fraksiyonu ekleyin. Sonra 1.5 hacim izopropanol ve 50 mikrogram eşit kurye ekleyin. RNA'yı gece boyunca eksi 20 derecede çökeltin.

Fraksiyonları 40 mililitrelik ultra santrifüj tüplerine aktarın ve tüpü izopropanol ile dengeleyin. Merkezkaç. Süpernatanı çıkarın ve peleti havayla kurutun. Peleti 200 mikrolitre ılık TE tamponunda tekrar süspanse edin.

Klasik bir fenol kloroform ekstraksiyonu gerçekleştirerek RNA'yı daha fazla ekstrakte edin. Arabidopsis'ten altı günlük fideden elde edilen polizomların temsili bir profili burada gösterilmektedir. Ana tepe noktası, tek bir ribozomla ilişkili mRNA olan monozoma karşılık gelir.

Profilin ilk kısmı, polisomal fraksiyonlara, yani birçok ribozomla ilişkili mRNA'ya karşılık gelir. Her zirve, yeni ribozomun mRNA ile ilişkisiyle eşleşir. Profilin son kısmı, serbest ribozomal alt birimleri ve RNA'yı içeren süpernatan fraksiyona karşılık gelir.

Büyük miktarda 60S alt birimi, monozom zirvesinin yanında bir omuz oluşturur. Bütünlüklerini değerlendirmek için, fraksiyonlardan ekstrakte edilen RNA'lar, daha sonraki deneyler için kullanılmadan önce klasik bir Aragose jeli üzerinde çalıştırılabilir. Bu protokolü, polizomları Arabidopsis thaliana fidelerinden, aynı zamanda genç ve yaşlı rozetlerden ve ayrıca Nicotiana benthamiana, domates ve pirinç yapraklarından izole etmek için kullandık, bu nedenle çok çeşitli bitki ve dokularla çalışmalıdır.

Saflaştırılmış RNA'lar, polizomal fraksiyonlarla ilişkili küçük RNA'ların tanımlanmasının yanı sıra mikro dizi analizi ile uyumludur.