Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme
1 Haziran 2021
Bu protokol, otomatik gradyan üreticileri veya gradyan fraksiyonasyon sistemleri kullanmadan bir çoklu profilin nasıl oluşturulacağını açıklar.
Bu protokol, hücre içindeki ribozomların aktivitesi hakkında moleküler ayrıntıları ortaya çıkaran bir polizom profilinin nasıl oluşturulacağını açıklar. Bu teknik, kullanıcıların otomatik gradyan fraksiyonasyon sistemlerine erişimi olmayan bir polizom profili tarafından sağlanan değerli bilgileri elde etmelerini sağlar. Degradeleri hazırlarken zaman ayırın ve gradyanları, doğrusal bir gradyana yerleşirken bir kompresör veya diğer mekanik işlemler tarafından bozulmayacakları bir yerde saklayın.
Başlamak için, sakkaroz gradyan tamponunda% 7 ve% 47 sakkaroz stok çözeltileri hazırlayın. Filtre, sakkaroz stok çözeltilerini 0,22 mikronluk bir filtreyle sterilize eder. %7 ve %47'lik stok çözeltilerini dağıtarak ve karıştırarak 17, 27 ve %37 oranında sakkaroz çözeltisi hazırlayın.
Altı polipropilen santrifüj tüpünü tam görünümlü bir test tüpü rafına yerleştirin. Tüpler arasında yeterli boşluk olduğundan emin olun, böylece bir tüple yapılan hareketler diğerlerini rahatsız etmez. Üç mililitrelik bir şırıngaya künt uçlu dokuz inçlik, 22 gauge bir iğne takın ve şırınganın gradyanları ayarlamadan önce sakkaroz çözeltisini damlamadan tutabilmesini sağlamak için bir test dolgusu yapın ve dağıtın.
Her santrifüj tüpünün dibine iki mililitre %7 sakkaroz ekleyin. Daha sonra, iğne ucunu tüp tabanının hemen yakınına yerleştirerek% 7'lik çözeltinin altına% 17 sakarozun iki mililitresini ekleyin. Çözeltiyi dikkatlice ve yavaşça dağıtın.
Prosedürü% 27, 37 ve% 47 sakkaroz çözeltisinin her biri iki mililitre ile tekrarlayın, her katmanın diğerinden yoğunlukların ayrılmasını gösteren bir çizgi ile ayırt edilebilmesini sağlayın. Gradyanları, sürekli, artan bir sakkaroz yüzdesine yerleşmelerini sağlamak için gece boyunca dört santigrat derecede saklayın. Mayanın büyümesi ve toplanmasından sonra, Saccharomyces cerevisiae hücreleri, soğutulmuş 700 mikrolitre polizom ekstraksiyon tamponunda hücreleri yeniden askıya alır.
100 birim RNAse İnhibitörü ekleyin. Ardından, yaklaşık 425 ila 600 mikron boyutunda 400 mikrolitre önceden soğutulmuş cam boncuk ekleyin. Karışımı cam boncuklarla 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve maya hücrelerini beş dakika boyunca bir boncuk çırpıcıda kuvvetli ajitasyonla bozun.
Hücreleri bozduktan sonra, santrifüjleme ile lizatı netleştirin. Floresan tabanlı bir RNA algılama sistemi kullanarak, absorbansı 260 nanometrede ölçerek arıtılmış lizattaki RNA konsantrasyonunu belirleyin. RNA konsantrasyonunun mikrolitre başına 0,5 ila bir mikrogram olduğundan emin olun.
RNA konsantrasyonu çok düşükse, hücreleri askıya almak için kullanılan ekstraksiyon tamponunun hacmini azaltın. Lisatı dikkatlice gradyanların üstüne yükleyin. Pipet ucunu polipropilen tüpün üst kısmındaki iç duvara yaslayın.
Tüpü açın ve lizatı yavaşça gradyanın üstüne dağıtın, duvara doğru sürün. Tüpleri yavaşça sallanan bir kova rotorunun önceden soğutulmuş kovalarına yerleştirin ve gradyanları santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra, santrifüj tüplerini sallanan kova rotorundan dikkatlice çıkarın ve bir tüp tutucuya yerleştirin.
Fraksiyonları saklamak ve buz üzerinde önceden soğutmak için 96 kuyucuklu plakaları etiketleyin. Degradenin tepesinden başlayarak 100 veya 200 mikrolitre fraksiyonu toplayın, gradyanın üstüne dikkatlice bir pipet ucu yerleştirin ve tüm gradyan aliquote olana kadar fraksiyonları toplayın. Her fraksiyonun 254 nanometredeki emilimini,% 7 ve% 47 sakkaroz çözeltilerine karşı boşluk olarak bir spektrofotometre ile ölçün.
Kesir sayısını absorbansa karşı çizerek çoklu profili oluşturun. Maya S.Cerevisiae'den üç temsili polizom profili gösterilmiştir. Her ribozomal alt birimin tepesi ve polizom zirvesi her profilde belirgindir.
Otomatik yoğunluk fraksiyonasyon sisteminden temsili bir profil burada gösterilmiştir. Bu profil, sakkaroz gradyanı aşağıdan yukarıya doğru bir kovalama çözeltisi ile, bir dedektör akış hücresi aracılığıyla yer değiştirdiği ve fraksiyonlar halinde toplandığı için sürekli bir absorbans profilinden üretildi. 200 ve 100 mikrolitrelik numunelerin elle parçalanmasıyla oluşturulan polizom profili burada gösterilmiştir.
Bu prosedürle hatırlanması gereken en önemli şey, gradyanları bozmamaktır. Hava kabarcıkları sokmamaya veya çözeltiyi çok hızlı dağıtarak gradyanı bozmamaya dikkat edin. Bu prosedürü takiben, RNA, aktif ribozomlarla ilişkili mRNA'ları belirlemek için daha fazla analiz için gradyanlardan ekstrakte edilebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, hücre içindeki ribozomların aktivitesi hakkında moleküler detaylar ortaya çıkaran bir polizom profilinin nasıl oluşturulacağını açıklamaktadır. Bu teknik, kullanıcıların otomatik gradyan fraksiyonlama sistemleri olmadan değerli bilgiler elde etmelerine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Moleküler Biyoloji
Arka Plan
- Polizom profilleme, ribozomal aktiviteyi anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Translasyon ve gen ekspresyonu hakkında bilgiler sağlar.
- Otomatik sistemler araştırmacılar için her zaman erişilebilir değildir.
- Bu protokol, gradyan hazırlama için alternatif bir yöntem sunmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Polizom profillerini oluşturmak için ayrıntılı bir yöntem sunmak.
- Çeşitli araştırma ortamlarında ribozomal aktivite analizini kolaylaştırmak.
- Otomatik sistemlere sahip olmayan araştırmacıların bu analizi gerçekleştirmesini sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Sükroz gradyan çözeltilerinin hazırlanması.
- Sükroz stok çözeltilerinin filtrelenmesi.
- Farklı sükroz konsantrasyonlarının kademeli olarak karıştırılması.
- Stabiliteyi korumak için gradyanların dikkatle saklanması.
Temel Sonuçlar
- Lineer bir sakroz gradyanının başarıyla oluşturulması.
- Otomatik sistemler olmadan ribozomal aktiviteyi analiz edebilme yeteneği.
- Polizom profilleme için güvenilir bir yöntemin sağlanması.
- Translasyonun moleküler mekanizmalarına dair içgörüler.
Sonuçlar
- Bu protokol, araştırmacılar için değerli bir kaynaktır.
- Polizom profilleme tekniklerine erişimi demokratikleştirmektedir.
- Gelecekteki çalışmalar, çeşitli uygulamalar için bu yöntemi temel alabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Polizom profilleme, spesifik mRNA'ların translasyonel aktivitesini ortaya çıkararak hedef doğrulamasının mekanistik risklerini azaltır ve erken keşif aşamasındaki öngörülebilir güveni destekler. Bu protokol, standart laboratuvar ekipmanları kullanılarak ribozom profilleri oluşturmak için maliyet etkin ve tekrarlanabilir bir yöntem sunarak, kaynakların kısıtlı olduğu ortamlarda translasyonel biyobelirteç analizine erişimi genişletmektedir. Pahalı fraksiyonlama sistemlerine ihtiyaç duymadan ribozomal etkileşimin kantitatif değerlendirmesini sağlayarak, hipotez testinden öncü bileşik tanımlamaya kadar olan iş akışının konumlandırılmasını destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Deneysel koşullar altında ribozomlarla aktif olarak etkileşen mRNA'ları tanımlayarak terapötik hipotezleri sorgulamak.
- Operasyonel Değer: Hastalıkla ilişkili sistemlerde translasyon çıktısının doğrudan ölçümü yoluyla fonksiyonel hedef doğrulaması sağlamak.
- Öngörücü Değer: Polizom kaymalarını yolak modülasyonu ve hedef etkileşimi ile ilişkilendirerek portföy önceliklendirmesini desteklemek.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analize Hazırlık: Temel translasyonel profiller oluşturarak, aşağı akıştaki bileşik taramaları için valide edilmiş biyolojik sistemleri hazırlayın.
- Tekrarlanabilirlik: Özel ekipman gerektirmeden tutarlı sakroz gradyanları oluşturun ve karşılaştırmalı analiz için güvenilir fraksiyonlama sağlayın.
- Kantitatif Çıktı: Hit doğrulama ve doz-yanıt değerlendirmesine olanak tanıyan, nicelleştirilebilir polizom profilleri üretmek için 254 nm'de absorbansı ölçün.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgili Önem: Preklinik modellerde translasyonel disregülasyonu incelemek için protokolü çeşitli hücre tiplerine uyarlayın.
- Mekanistik Risk Azaltma: Hedef modülasyonunu ribozom profillemeledeki değişikliklerle ilişkilendirerek etki mekanizmasındaki belirsizliği azaltın.
- Translasyonel Süreklilik: Aktif ribozomlarla ilişkili mRNA'ları tanımlamak için fraksiyonlardan RNA ekstre ederek biyobelirteç uyumunu destekleyin.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur ve preklinik aşamaya geçmeden önce ribozom profillemenin fonksiyonel bir okuma olarak kullanılmasına olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: Hangi transkriptlerin translasyonel olarak aktif olduğunu ortaya çıkararak hipotez testlerini destekler ve transkripsiyonel değişikliklerin ötesindeki yolak katılımını netleştirir.
- Tarama: Tekrarlanabilir gradyan oluşumu yoluyla analiz standardizasyonuna olanak tanır ve bileşiklerin translasyonel çıktı üzerindeki etkilerinin güvenilir şekilde karşılaştırılmasını sağlar.
- Analitik: Ekiplerin farklı koşullar arasındaki ribozomal etkileşimi karşılaştırmasına olanak tanıyan nicel bağımlı değişken ölçümleri (254 nm'de absorbans) sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Translasyonel olarak düzenlenen biyobelirteçlerin daha ileri analizi için polisomla ilişkili RNA ekstraksiyonunu mümkün kılarak preklinik çalışmalarla bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Projeler genelinde ribozomal aktivite analizi için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik oluşturarak merkezi çekirdek tesisli bağımlılığını azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Translasyonel aktivitenin doğrudan ölçümü yoluyla hedef doğrulamasında öngörücü güvenin artırılması ve mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Erişilebilir laboratuvar ekipmanları kullanılarak gradyan hazırlamanın standardizasyonu vele tekrarlanabilirliği.
- Stratejik Değer: Hedef etkileşiminin translasyonel düzeyde erken değerlendirilmesine olanak tanıyarak geliştirme/durdurma (go/no-go) kararlarının iyileştirilmesi.
- Portföy Etkisi: Polizom profilleme verilerine dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirme ile geç aşama biyolojik risklerin azaltılması.
Uygulama Hususları
- Sükroz katmanlarının bozulmasını önlemek için gradyan hazırlama konusunda uzmanlık ve dikkatli işlem gerektirir.
- Lizat hazırlığı için salınım kovalı rotor, spektrofotometre ve boncuklu parçalayıcıya erişim gereklidir.
- Fraksiyon toplama ve absorbans ölçüm protokollerinde ekipler arası standartlaştırma gerektirir.
- Lizis ve polizom stabilitesindeki farklılıklar nedeniyle, memeli veya bitki hücre tiplerine uygulandığında adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Pratik sınırlama: Manuel fraksiyonlama, otomatik sistemlere göre daha düşük işlem hacmine sahiptir ve yüksek hacimli taramalardan ziyade doğrulama işlemleri için uygundur.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:39
Preparation of 7 to 47% Sucrose Gradients
2:14
Preparation of Yeast Cell Extracts
3:21
Centrifugation of Gradients
3:49
Fraction and Data Collection
4:36
Results: Polysome Profiling Without Gradient Makers or Fractionation Systems
5:19
Conclusion
