Matrix Rijitlik Akrilamid tabanlı Hidrojeller kullanarak Hücresel Fonksiyon Üzerindeki Etkilerinin incelenmesi

Akrilamid hidrojelleri kullanarak in vivo doku kompliyansını modellemek. Bu işlem, öncelikle reaktif alt lamel ve silikonize üst lamellerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise akrilamid hidrojellerinin dökülmesi ve oluşturulmasıdır.

Prosedürün üçüncü adımı, seçilen hücre dışı matris proteininin hidrojele çapraz bağlanmasıdır. Prosedürün son adımı ise hücrelerin inkübasyonu ve analizidir. Sonuç olarak, immunofloresan mikroskobi, gerçek zamanlı kantitatif PCR ve western blotting analizleri kullanılarak, in vitro ortamdaki farklı hücre dışı matris kompliansının hücre davranışını nasıl düzenlediğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bugün size akrilamid hidrojellerin üretimi ve kullanımı prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda, hücre morfolojisini, hücre sinyalizasyonunu ve proliferasyonunu düzenleyen hücre dışı matris sertliğini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Bu prosedüre reaktif lameller hazırlayarak başlayın. Önce, 150 milimetrelik bir Petri kabının alt yarısına bir kat parafilm yerleştirin. Ardından, dokuz adede kadar otoklavlanmış 25 milimetrelik lamelin parafilm üzerine aktarın ve üzerlerini bir mililitre 0,1 molar sodyum hidroksit ile kaplayın.

Lamelleri üç dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, kimyasal çeker ocak içinde çalışan bir vakum hattı ile sodyum hidroksiti aspire edin. Her lamelin üzerine 0,5 mililitre üç amino profil trimetilsilan (3-APTMS) pipetleyin. Lamelleri üç dakika boyunca inkübe edin ve ardından 3-APTMS'yi aspire edin. Lamel üzerinde köpük oluşumunu önlemek için çok uzun süre inkübe etmemeye dikkat edin.

İşlem sonrası lameller. Aynı kap içerisinde lamelleri bir kez 20 milliliters deiyonize su ile durulayın. Lamelleri kavisli pens kullanarak kaptan çıkarın ve işlem gören yüzeyleri yukarı bakacak şekilde yeni bir 150 millimeter kaba aktarın.

Ardından lamelleri tekrar deiyonize su ile yıkayın ve 10 dakika boyunca sallayıcıya yerleştirin. İnkübasyonun ardından suyu uzaklaştırın ve iki kez daha yıkayın. Glutaraldehit ile reaksiyona girip bulutlu beyaz bir çökelek oluşturmaması için, glutaraldehit kullanımından 10 dakika önce tüm A-P-T-M-S'nin uzaklaştırılması çok önemlidir.

Kavisli pensler kullanarak, lamine lamelleri param ile kaplanmış temiz bir kaba aktarın ve kalan sıvıyı bir vakum hattı yardımıyla aspire edin; ardından, üç A-P-T-M-S ve poliakrilamid jeli çapraz bağlamak için her bir lamine lamelin üzerini steril deiyonize su içindeki 0,5% glutaraldehitten 0,5 milliliters ile tamamen kaplayın. Lamine lamelleri bir kimyasal çeker ocak içerisinde 30 dakika inkübe edin. Daha sonra glutaraldehit durulama solüsyonunu aspire edin ve lamine lamelleri tekrar deiyonize su ile yıkayın.

Ardından lamelleri tamamen kurutun. Kloroform içinde %10'luk yüzey mühürleme çözeltisi içeren 50 mililitrelik bir Falcon tüpüne yeni lameller ekleyin ve en az 10 dakika boyunca sallayın. Yüzey mühürleme çözeltisini dökün ve havada kurutun.

Hidrojellerin hazırlanacağı biyolojik güvenlik kabininde, lamine lamlar Kim mendiller üzerine yerleştirilerek hidrojel hazırlığına başlanır. Kavisli penseler kullanarak lamine lamları, biyolojik güvenlik kabininin yüzeyine bantlanmış bir paraform levhasına reaktif yüzeyleri yukarı gelecek şekilde aktarın. Lamine lamların paraform yüzeyinde düz olduğundan emin olun.

Ardından, yeterli miktarda toluen içerisine küçük bir miktar NHS çözerek toluen içinde doygun bir NHS çözeltisi hazırlayın. Spesifik deneyler için, NHS artık çözünmeyene kadar küçük miktarlarda NHS ekleyin. Doygun çözelti genellikle bulanık ve pembe renklidir.

Ardından, istenen akrilamid yüzdesine ulaşmak için akrilamid, BIS akrilamid, su ve PS hazırlayın. Yazılı protokolde belirtildiği gibi reaktifleri mikro tüplere ekleyin. Daha sonra her seferinde bir alikot ekleyin.

NHS ve TM ekleyin. Tüpü kısa bir süre vorteksleyin ve ardından biyolojik güvenlik kabininde, her bir lam için 140 µL kullanarak üç ila beş jele hemen paylaştırın. Polimerizasyon başlamadan önce, her jelin üzerine hızlıca SİLİKONİZE 25 mm lam yerleştirin.

Üst örtü camının eklenmesi, akrilamidin alt örtü camını tamamen kaplamasını sağlayacaktır. Polimerizasyonun gerçekleşip gerçekleşmediğini belirlemek için bu sandviç yapıyı, akrilamid polimerleşene kadar oda sıcaklığında inkübe edin. Mikro santrifüj tüpündeki kalıntı akrilamid solüsyonunu kontrol edin.

Polimerizasyon işlemi, sert jeller için birkaç dakika, yumuşak jeller için ise biraz daha uzun sürecektir. Polimerizasyon gerçekleştiğinde, steril eldivenler giyerek sandviç yapıyı dikkatlice kaldırın. Ardından, üst kapatma lamını, polimerize olmuş jelin üzerinden taşana kadar kaydırarak çıkarın.

Ardından kapağı kanırtarak açın. Jeli yerinden çıkarın, üst örtü camını atın. Bundan sonra hidrojel olarak adlandırılan her bir alt jel örtü camını altı kuyucuklu bir plakaya yerleştirin.

Ardından, altı kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa iki mililitre fosfat tamponlu salin veya PBS ekleyin. Daha sonra hidrojelleri PBS ile yıkayın ve bir sallayıcı üzerinde beş dakika inkübe edin. Bu yıkama işlemini iki kez tekrarlayın.

Deneye başlamak için, her bir hidrojeli iki mililitre fibronectin çözeltisi veya diğer hücre dışı matris proteini ile kaplayın. Proteinin hidrojele kovalent olarak bağlanmasını sağlamak için proteini hidrojel üzerinde dört derece Celsius'da gece boyunca inkübe edin; gece boyu süren inkübasyonun ardından ECM çözeltisini aspire edin. Ardından, reaksiyona girmemiş NHS'yi, serumsuz ortamda bir miligram her mililitre ısı ile aktive edilmiş yağsız sığır serum albümini ile bloke edin ve 37 derece Celsius'da en az 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyonu takiben, hidrojelleri bir kez steril PBS ile yıkayın. Ardından hücreleri, fetal bovin serum içeren uygun kültür ortamında, buradaki hidrojelin üzerine ekleyin.

Kurulmuş fare embriyonik fibroblastları kullanılır. Hidrojel üzerine ekilecek hücre sayısını, deney için gerekli olan hücre yayılım derecesine ve konfluense göre belirleyin. Western blot ve kantitatif PCR analizi için yaklaşık 10⁵ hücre gereklidir.

Ardından hücreleri, ilgili hücre tipi için uygun koşullarda inkübe edin. İnkübasyon süresinin ardından, ihtiyaca göre hücre proteinini veya mRNA'yı ekstrakte edin.

Laboratuvar tezgahındaki bir parafilm tabakası üzerine, her bir damlacık arasında yaklaşık iki ila üç santimetre boşluk bırakacak şekilde 100 µL'lik lizis tamponu damlacıkları pipetleyin. Ardından, kuyucuktan alt kapatma lamelini kaldırarak her bir hidrojeli dikkatlice çıkarın. Eğri pens kullanarak, hücre tarafı damlacıkların üzerine gelecek şekilde yerleştirin.

Hücreleri lizis tamponu ile tam bir dakika boyunca inkübe edin. Son olarak, lamel camlarını çıkarın ve lizis tamponunu bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Alternatif olarak, RNA ekstraksiyonu yapılırken her bir hidrojeli yeni bir altı kuyucuklu plakaya aktarın ve her kuyucuğa bir mililitre triazol ekleyin.

İnkübasyonun ardından jelleri üç dakika boyunca inkübe edin. Triazol çözeltisini, bir mikro santrifüj tüpünde saklamak üzere uzaklaştırın. A-P-T-M-S eklemesinin ardından lamel örtülerin iyice yıkanması, reaktif lamel örtüler üretmede önemli bir adımdır.

Uygun şekilde yıkanmış ve kurutulmuş lameller herhangi bir kalıntı çökelek içermez. A-P-T-M-S, glutaraldehit ile reaksiyona girerek beyaz, bulanık bir çökelek oluşturacaktır. Çökelek oluşursa, lamel artık kullanılamaz hale geldiği için tüm prosedür tekrarlanmalıdır.

Hidrojel oluşumu ve ECM proteinleri ile kaplama işleminin ardından, hücreler gece boyunca ekilir. Boyamada görülebileceği üzere, sert ve yumuşak hidrojeller üzerinde yayılan hücreler arasında belirgin bir fark vardır; fare embriyonik fibroblast hücreleri, yumuşak hidrojellere kıyasla sert hidrojeller üzerinde daha geniş bir şekilde yayılır. Nitekim, yumuşak bir hidrojele tutunan çoğu hücre kompakt kalacak ve daha az verimli şekilde tutunacaktır.

Fare embriyonik fibroblastlarındaki cycling D 1 mRNA seviyelerinin temsilci kantitatif PCR sonuçları, cycling D 1'in sert bir matriks üzerinde önemli ölçüde yukarı regüle edildiğini, ancak yumuşak bir matriks üzerinde edilmediğini göstermektedir. Bu durum, matriks sertliğinin in vitro hücre döngüsü ilerlemesini düzenlediğini göstermektedir. Size, in vivo fizyolojik koşulları modelleyen farklı sertliklerde hidrojel üretimini nasıl gerçekleştireceğinizi gösterdik. Bu prosedürü uygularken, kaza ve hatalar meydana gelebileceği için fazladan reaktif lamine camlar hazırlamanın önemli olduğunu unutmayın.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.