X-ray Kristalografi Protein Kristalizasyon

Bu prosedürün genel amacı, X-ışını kırınımı deneyleri için protein kristalleri üretmektir. Kristal tarama için üç farklı teknik olan, asılı damla (hanging drop) ve oturan damla (sitting drop) yöntemlerini içeren buhar difüzyonu kristalleştirme yöntemlerinin yanı sıra, buhar difüzyonu kristalleştirme için mikro parti (micro batch) kristalleştirme yöntemleri açıklanmaktadır. Kuyucuklar çöktürücü ile doldurulur.

Ardından, yüksek konsantrasyonlu saflaştırılmış protein örneği çöktürücü ajanla karıştırılır. Karıştırılan damla daha sonra çöktürücü çözelti içeren bir kuyucuğa yerleştirilerek mühürlenir. Mikro batch kristalizasyonu, kuyucuğun parafin yağı ile doldurulmasıyla başlar.

Ardından protein kuyucuklara yüklenir ve bunu çöktürücü çözelti izler. Tüm yöntemlerin son adımı, sistemin dengelenmesini sağlamak ve damlacıklar içindeki kristal oluşumunu ve büyümesini takip etmektir. Nihayetinde, bu teknikle kristaller elde edilebilir ve uygun bir dedektöre sahip bir x-ışını kaynağı kullanılarak protein difraksiyon deseni belirlenebilir.

Merhaba, ben Yale Üniversitesi Moleküler Biyofizik ve Biyokimya Bölümü'ndeki Profesör Yoga Motis laboratuvarından Sal. Bugün size saflaştırılmış bir proteinin kristalizasyon prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, viral enfeksiyonun yapısal temellerini incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım ve bazı kristaller yetiştirelim. Seçilen bir makromolekül için bir kristalizasyon yöntemini belirlemek amacıyla, deneme koşullarının seyrek matris eksik faktöriyel yönteminden yararlanmak için seçilen, ticari olarak temin edilebilen kristalizasyon çözeltileri kullanılarak başlangıç taramaları gerçekleştirilebilir. Bu koşullar, makromoleküller için bilinen ve yaygın olarak başarılı olan kristalizasyon koşullarına göre seçilir.

Kristalleşme koşulu belirlendikten sonra, orijinal sonucun etrafındaki pH değerlerinde çöktürücü konsantrasyonunu değiştirerek dar kapsamlı bir tarama oluşturulabilir. Genellikle bu taramalar için kullanılan kristalleşme koşulları, bir çöktürücü madde ve pH'ı ayarlamak için bir tampondan oluşur; bu gösterim için tüm stok çözeltiler 0,22 mikronluk bir filtreden süzülmelidir. Tavuk lizozomu için önceden tanımlanmış olan kristalleşme koşulları, çöktürücü olarak sodyum klorür ile kullanılır; prosedüre, çeşitli pH değerlerindeki 0,1 molar sodyum asetat içerisinde farklı konsantrasyonlarda sodyum klorür içeren bir mililitrelik çözeltiler hazırlayarak başlayın.

Ardından, -80 °C'de saklanan protein örneği çözdürülür ve buz üzerinde tutulur. Tipik protein konsantrasyonları 5 ila 50 mg/mL aralığındadır ve genellikle daha yüksek konsantrasyonlar daha iyi sonuçlar verir. Burada, 0.02 molar sodyum asetat pH 4.9 içerisinde 50 mg/mL konsantrasyonunda tavuk yumurtası lizozim çözeltisi kullanılmıştır.

Çözdürme adımından kaynaklanan kısmi agregasyon göstermiş proteinleri veya çökelmeleri uzaklaştırmak için örneği 18,000 G'de ve dört derece Celsius'ta 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Bu agregatlar kristal büyümesini engelleyebilir ve daha fazla agregasyonu teşvik edebilir. Santrifüj işleminin ardından.

Bir UV spektrofotometre kullanarak protein konsantrasyonunu 280 nanometredeki absorbans değerinden belirleyin. Protein konsantrasyonu, absorbans okuması ve proteinin sönümleme katsayısından hesaplanabilir. Protein örneği hazır olduğunda, 24 kuyucuklu asılı oturan damla kristalizasyon tepsisini, tepsi haritasına göre 500 microliters çöktürücü çözelti ile doldurun.

Havanın kuyucuk tavanından çıkabilmesi için halkayı tamamen kapatmadan, her bir kuyucuğun kenarı boyunca silikon gresle bir halka oluşturun. Kristalizasyon damlalarının yorumlanmasını kolaylaştırmak ve kontaminasyonları önlemek için, tozdan kaçınmak amacıyla örtü camını basınçlı hava spreyi veya profesyonel bir mendil ile temizleyin. Bir sonraki adım, protein örneğinden ve rezervuar çözeltisinden eşit hacimlerde örtü camı üzerine pipetlemektir.

Bununla birlikte, optimizasyon sürecinin bir parçası olarak farklı protein ve çöktürücü hacimleri denenebilir; çöktürücüden daha fazla protein kullanılması, dengelenmiş damladaki net protein konsantrasyonunun artmasını sağlar ki bu durum, seyreltik protein örnekleri için veya kristal çekirdeklenmesini ya da büyümesini yavaşlatmak için istenebilir. Bu gösterim için, 0,02 molar sodyum asetat (pH 4) içerisinde 50 mg/mL liyozimden iki µL, lamel camın merkezine yüklenir ve ardından iki µL kristallendirme çözeltisi eklenir.

Proteini ve rezervuar çözeltisini lamel üzerine pipetlerken, genellikle pipetten hava boşaltılırken meydana gelen kabarcık oluşumunu önlemek için son derece dikkatli olun. Damla içindeki yerel yüksek çöktürücü konsantrasyonları nedeniyle proteinin erken çökelmesini önlemek için damlayı nazikçe karıştırın; viskoz çöktürücüler (polietilen glikol gibi) kullanıldığında karıştırma işlemi özellikle önemlidir. Lameli cımbız yardımıyla nazikçe ters çevirin ve kuyucuğun üstündeki gres halkasının üzerine yerleştirin; havanın kuyucuktan çıkabilmesi için bu işlemi yönlü bir şekilde gerçekleştirin.

Aksi takdirde, hava örtü camını kaldırarak kuyucuk sızdırmazlığını bozabilir. Tepsi tamamlanana kadar bir sonraki kuyucuğa geçin. Tepsi hazırlandıktan sonra, protein kristallerinin yanlış pozitif tanımlanma riskini azaltabilecek toz partiküllerini ve diğer kontaminantları temizleyerek tepsiyi görsel olarak inceleyin.

Deneyi belgelemek için bir puanlama çizelgesi kullanın. Ardından, tepsiyi genellikle 4 °C ile oda sıcaklığı arasında olan istenen inkübasyon sıcaklığına yerleştirin. En başarılı sonuç veren sıcaklık 20 °C'dir.

Transfer veya inkübasyon sırasında tepsinin nazikçe taşınmasına özen gösterin; sarsıntı, titreşim veya sıcaklık değişimlerinden kaçının, çünkü bunlar kristal büyümesini engelleyebilir veya kristal kalitesini olumsuz etkileyebilir. Ertesi gün ve ardından birkaç günde bir tepsiyi kristaller açısından kontrol edin ve tepsileri her zaman dikkatle taşıyın. Tüm bulguları ve damla morfolojilerini tepsiye özel bir değerlendirme formuna kaydedin.

Kristaller genellikle iki ila beş gün içinde ortaya çıkar, ancak kristaller bazen neredeyse anında veya birkaç ay sonra da belirebilir. Kristalizasyon koşulları belirlendikten ve kristallerin büyüme hızı öğrenildikten sonra, kristaller ortaya çıkana ve nihai boyutlarının en az yarısına ulaşana kadar tepsileri rahatsız etmeden bırakmak en iyisidir. Tepsileri sabit tutmak, kristal çekirdeklenme olaylarının sayısını azaltarak daha az sayıda ancak daha büyük kristallerin oluşmasını sağlayabilir. Oturan damla kristalizasyonu için, lam kapaklarının gerekmediği 24 kuyucuklu bir oturan damla tepsisi kullanılması dışında, asılı damla yöntemiyle aynı prosedür izlenir.

Bunun yerine kuyucuk, protein ve çöktürücünün karıştırıldığı bir platforma sahiptir; hava kabarcığı oluşumundan kaçınarak, 50 mg/mL lisozim çözeltisinden iki µL'yi platformun merkezine pipetleyin. Ardından, tepsi kurulumundan sonra örneğe iki µL çöktürücü çözelti ekleyin. Oturan damla yöntemini kullanarak kuyucukları optik bantla mühürleyin.

Lamel kullanılmasına gerek yoktur. İnkübasyona ve kristal skorlamaya, asılı damla yöntemi için açıklandığı şekilde devam edin. Mikro parti prosedürünü gerçekleştirmek için.

Kristalizasyon çözeltisini ve proteini, asılı damla prosedüründe açıklandığı şekilde hazırlayın. Mikro batch tepsisinde toz ve diğer büyük partiküllerin oluşmasını önlemek için yeni bir mikro batch tepsisi temin edin ve hava spreyi ile temizleyin. Her bir kuyucuğa üç milimetre derinliğe gelecek şekilde parafin yağı ekleyin.

Ardından fazla yağı uzaklaştırın. Sonra, damlanın kuyucuğun tabanına çöktüğünden emin olarak, önceden doldurulmuş kuyucuğa bir mikrolitre protein çözeltisi yükleyin. Daha sonra kuyucuğa bir mikrolitre çöktürücü çözelti yükleyin.

Damlanın kuyucuğun dibine çöktüğünden ve protein damlacığı ile birleştiğinden emin olun. Tepsi tamamlanana kadar bir sonraki kuyucuğa geçin ve burada açıklandığı şekilde inkübasyon ve kristal analizine devam edin. Protein kristalleşmesinin tipik sonuçları.

Deneyler gösterilmiştir. Protein ve/veya çöktürücü yüksek konsantrasyonda olduğunda amorf çökelme meydana gelir. Aksine, doymamış damlalar genellikle berrak kalır.

Protein veya deterjan, yüksek konsantrasyonda belirli çöktürücülerle karıştırıldığında farklı bir faza ayrışırsa faz ayrımı meydana gelebilir. Optimal koşullar altında, Arabidopsis csn protein kristalleri oluşmalıdır. Polietilen glikol 8,000 ve magnezyum asetat ile elde edilen yedi protein kristali çubuk şeklinde görünmektedir.

Ayrıca gösterilen kristaller, 1 molar sodyum klorür ve sodyum asetat, pH 4.9 içerisinde elde edilen lizozom protein kristalleridir. Bu hızlandırılmış video, asılı damla yöntemi kullanıldığında, lizozom kristallerinin kurulumdan sonra birkaç saat içinde büyük prizmalara dönüştüğünü göstermektedir.

Bu prosedürü uygularken bir protein deneyinin nasıl kurulacağını size göstermiş olduk. Sıcaklık ve nemin istikrarlı şekilde kontrol edildiği bir ortamda çalışmak önemlidir; yüksek nem damla buharlaşmasını en aza indirmeye yardımcı olduğundan, damlanın açık havaya maruziyetini minimize eden bir teknik benimsemeye çalışın. Bu nedenle, iyi organize edilmiş bir çalışma ortamında faaliyet göstermek esastır.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.