Mikrodiyaliz ile Yüksek Verimli Protein Kristalizasyonu

Diyaliz ile kristalizasyon az kullanılan bir yöntemdir. Bu protokol, yapılandırılmış belirleme için şu anda mevcut olan kristalleşme stratejilerinin aralığını artıracak olan Novo yaklaşımını sunmaktadır. Bu tekniğin temel avantajları, yüksek verim olması, özel ekipman gerektirmeden kurulumunun basit olması ve kristal büyümesinin kolayca izlenmesine izin vermesidir.

Bu tekniği uygulayan kişi, düşük hacimli pipetleme ve çok kanallı pipetler kullanma konusunda rahat olmalıdır. Damlalar, kısmi dehidrasyonu önlemek için mümkün olduğunca yeterince pipetlenmelidir. Mikrodiyaliz deneyini kurmak için, piyasada satılan 96 delikli bir mikrodiyaliz plakasını protein tarafı yukarı doğru yerleştirin ve 200 mikron basınçlı yapışkan ara parçayı soyarak yapışkan kapak bandını çıkarın.

Yapışkan kapak bandını soyduktan sonra, A1 kuyusunun konumuna dikkat edin. Daha sonra, çok kanallı bir pipet kullanarak, her bir kuyucuğa maksimum 3,2 mikrolitre uygun şekilde hazırlanmış protein numunesi yükleyin. 200 mikron UV kapak filmini, film yukarı bakacak şekilde 96 delikli plakanın üzerine düzgün bir şekilde yerleştirin. Ardından, basınç yapıştırıcısını etkinleştirmek ve kapatmak için, bir sızdırmazlık küreği kullanarak UV kapak filmine bastırın ve bütünlüğünü kontrol edin.

Şimdi, tampon tarafına yukarı doğru getirmek için plakayı ters çevirin ve A1 işaretli kuyucuğun aynalı konumunu not edin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, plakanın her bir kuyucuğuna maksimum 350 mikrolitre diyaliz çözeltisi yükleyin ve kuyucukları rezervuar kapak filmi ile dikkatlice kapatın. Ardından, kristal büyümesine izin vermek için plakayı tampon tarafına yukarı doğru 20 santigrat derecede uygun bir sıcaklık kontrollü inkübatörün içine yerleştirin. Mikroskop altında kristal oluşumunu incelemek için, koruyucu kapak filmini 200 mikronluk UV kapak filminden çıkarın ve plakayı protein tarafı yukarı bakacak şekilde göz merceğinin altına yerleştirin.

Büyük ölçekli bir kristalleşme deneyi oluşturmak için, mikrodiyaliz plakasında mikro kristal büyümesinin meydana geldiği koşulları benimseyin ve aynı koşulları büyük kaplarda çoğaltın. Diyaliz çözeltisinin hacmine bağlı olarak kap boyutunu seçin. Kırmızı plastik kapağı kullanarak tüpü kapatmadan önce diyalizör tüpüne maksimum 500 mikrolitre protein numunesi pipetleyin.

Mühürlü 500 mikrolitrelik diyalizör tüpünü, diyaliz çözeltisi ile doldurulmuş kabın içindeki yüzer rafa yerleştirin. Daha sonra, kristal büyümesini sağlamak için kabı 20 santigrat derecede uygun bir sıcaklık kontrollü inkübatörün içine rahatsız edilmeden yerleştirin. Kristallerin oluşumunu kontrol etmek için, çözeltinin bir ila iki mikrolitresini diyalizörden bir cam kapak sürgüsüne pipetin.

Çözeltiyi slaytta başka bir cam slaytla örtün ve mikroskop altında görüntüleyin. Stereo yüksek büyütmeli bir mikroskop kullanılarak yakalanan görüntüler, 10 kilodalton moleküler ağırlık kesme membranlarına sahip mikrodiyaliz plakaları kullanılarak dört proteinin başarılı mikrokristal oluşumunu gösterdi. Lizozimin, uygun katkı maddeleri içeren pH 4'te 0.1 molar sodyum asetata karşı diyalize edildiğinde kristaller oluşturduğu bulunmuştur.

Domatin, uygun katkı maddeleri içeren pH 6.6'da 0.1 molar bis-tris propan ile diyaliz edildiğinde kristaller oluşturdu. Optimize edilmiş diyaliz koşulları, membran proteinleri, yani E.coli çoklu ilaç efflux pompa proteini AcrB ve E.coli laktoz taşıyıcısı LacY tarafından mikrokristal oluşumuna yol açmıştır. Mikrodiyaliz deneylerinden elde edilen optimize edilmiş diyaliz koşullarını kullanan diyalizör tüplerindeki büyük ölçekli kristalleşme, proteinlerin her biri için binlerce mikrokristalin oluşmasına yol açmıştır.

Fomitinin kristalleşmesi için, diyaliz çözeltisinin 50 mililitresine karşı 250 mikrolitre protein diyalize edildi. AcrB için, 250 mikrolitre protein, 25 mikrolitre diyaliz çözeltisine karşı diyalize edildi. LacY kristalizasyonu da aynı oranda, 100 mikrolitre protein ila 10 mililitre diyaliz çözeltisi ile kuruldu.

Plakayı tampon tarafına doğru çevirirken, A1'in konumunu not etmek önemlidir, böylece kristalizasyon eleğinden gelen çözeltiler buna göre dağıtılabilir. Bu yöntemden elde edilen kristaller, seri kristalografi ve mikro ED gibi aşağı akış uygulamaları için kullanılabilir.