Mikroenjeksiyon tarafından Memeli Hücreleri mRNA Nükleer İhracat Kinetik Analizi

Bu prosedürün genel amacı, memeli hücrelerde mRNA nükleer eksport kinetiğini ölçmektir. Bu işlem, öncelikle memeli doku kültürü hücrelerinin çekirdeklerine mikroenjeksiyon yoluyla mRNA veya DNA enjekte edilerek gerçekleştirilir. Mikroenjeksiyonun ardından, örnekler çeşitli inkübasyon sürelerinden sonra fikse edilir.

Ardından mRNA, floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile boyanır. Prosedürün son adımı, hücrelerin görüntülenmesi ve sitoplazma ile çekirdekteki floresans miktarının belirlenmesidir. Nihayetinde, mRNA eksport hızı, mikroenjeksiyon ve floresan mikroskobinin kombinasyonu ile ölçülebilir.

Merhaba, ben Toronto Üniversitesi Biyokimya Bölümü'ndeki Alex Palazzo laboratuvarından SRG AV. Ben de yine Palazzo Laboratuvarı'ndan Stefan Toski. Ben Palazzo laboratuvarından Amy ve ben de Palazzo laboratuvarından Khi Maha David.

Bugün sizlere, mikroenjeksiyon yoluyla memeli doku kültürü hücrelerinin çekirdeklerine mRNA aktarma prosedürünü göstereceğiz. Ayrıca, floresan in situ hibridizasyon ile mRNA'nın nasıl boyanacağını da uygulamalı olarak göstereceğiz. Laboratuvarımızda, memeli hücrelerdeki mRNA nükleer ihracat kinetiğini incelemek için bu prosedürleri kullanmaktayız.

Öyleyse başlayalım. Mikroenjeksiyon öncesinde, önceden hazırlanmış plazma DNA'sını enjeksiyon tamponunda mililitre başına 50 ile 200 mikrogram arasına dilüe edin. Ardından, enjekte edilen hücrelerin tanımlanmasını sağlamak için karışıma 70 kilodalton dekstrana konjugle edilmiş Oregon Green 488 veya OG ekleyin.

OG konjuge dekstran, sıvının ne kadarının çekirdeğe enjekte edildiğini ve ne kadarının sitoplazmaya sızdığını belirlemeye yardımcı olacaktır. İğne ucunu potansiyel olarak tıkayabilecek partiküler maddeleri çöktürmek için örnekleri 13.000 G ve dört derece Celsius sıcaklıkta en az 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Mikroenjeksiyon yapılacak memeli hücre hattını, yazılı protokol maliyetinde açıklanan kriterlere göre seçin.

Bu gösterim tohumu için yedi hücre kullanılmaktadır. Hücreler, mikroenjeksiyondan en az 24 saat önce 30 milimetrelik Petri kaplarındaki asitle yıkanmış lameller üzerine yerleştirilir. İdeal olarak, enjekte edilen hücrelerin kolayca tanımlanabilmesi için enjeksiyon sırasında hücre monokatmanının yaklaşık %70 ila %90 konfluens düzeyinde olması gerekir; hücre monokatmanı, enjeksiyondan önce 200 mikrolitrelik plastik pipet ucu kullanılarak yaralanır.

Lamel üzerine artı şeklinde bir çizik atın ve hücreleri enjeksiyondan önce doku kültürü inkübatöründe en az 15 dakika boyunca dinlenmeye bırakın. Mikroenjeksiyon için, mikroenjeksiyon işlemini bozabilecek titreşimleri en aza indirmek amacıyla hava tablası üzerinde izole edilmiş bir ters mikroskop kullanın. Peleti bozmamak için, bir jel yükleme ucu kullanarak santrifüj örneğinin üst kısmından yaklaşık 1 µL sıvı alın.

Pipetin ucunu önceden hazırlanmış bir mikroenjeksiyon iğnesinin arka kısmına yerleştirin ve sıvıyı boşaltın. Sıvı, kılcal etkiyle iğne ucuna çekilecektir. Beş ila 30 saniye içinde uç kısmına yakın bir menisküs görünür hale gelmelidir.

Sıvı dolu iğneyi değneğin içine yerleştirin ve mikro manipülatöre sabitleyin. 10x objektif kullanarak iğneyi 45 derecelik bir açıyla görüntüleyin ve odak düzleminin yakınında, görüş alanının merkezine konumlandırın. Kaba mikro manipülatör düğmelerini kullanarak, değneğin bir tüp aracılığıyla bağlı olduğu ve sıvıyı iğne ucundan püskürtmek için gerekli basıncı oluşturmaya yarayan cam şırıngayı kullanın.

Sabit bir basınç sağlamak için şırınga bir boru kelepçesine monte edilir. İğnenin sonraki adımlarda zarar görmesini önlemek için iki kauçuk tıpa ve iki metal kelepçe kullanarak iğneyi birkaç milimetre yükseltin ve ardından mikroskobu geri çekin. Şırınga pistonunu iterek basıncı artırın.

0,5 ile iki santimetreküp arası. Yaralanmış bir monokatman içeren lamel bulunan bir Petri kabını yerleştirin. Gözlem aşamasında, mikroskobu geri çekin.

Kondansatörün iğnenin sıvıya girmesini sağlayacak şekilde hizalanması için sütunu dik konuma getirin. İğnenin lamel üzerinde kırılmasını önlemek için bu işlem dikkatle yapılmalıdır. 10 x objektif kullanarak, çapraz sargının merkezini belirleyin ve iğneyi enjekte edilecek hücrelerin üzerine konumlandırın.

40 x objektife geçerek büyütmeyi artırın. Ardından, joystick üzerindeki ince ayar düğmelerini kullanarak iğneyi indirin ve merkezleyin. İğneyi çekirdekle temas edecek şekilde indirerek, yara artı işaretinin bir köşesinden enjeksiyona başlayın.

Enjeksiyon yapıldıktan sonra, hücrenin faz parlaklığında belirgin bir değişim olur. Yara haçının bir kenarı boyunca devam edin. Görselleştirme sırasında enjekte edilen hücrelerin kolayca tanımlanabilmesi için, enjeksiyon basıncının her iğne için uygun şekilde ayarlanması kritik öneme sahiptir.

Basınç, plazma ve nükleer membranları delecek kadar yüksek olmalı, ancak hücreleri öldürecek kadar yüksek olmamalıdır. Hücreleri, yara kenarı boyunca belirli bir süre boyunca mikroenjekte edin. Pratikle, bu süre zarfında birkaç yüz hücre enjekte edilebilir.

Plazmid DNA enjekte ediliyorsa, fiksasyondan önce mikroenjeksiyon yapılan hücreleri bir doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de 20 dakika inkübe edin, ardından transkripsiyonu sonlandırın. Hücreleri, büyüme ortamında çözünmüş 1 µg/mL α-amanitin ile muamele edin. Bu konsantrasyon, mikroenjekte edilen plazmidlerden transkripsiyonu etkili bir şekilde inhibe eder.

Hücreleri inkübatöre geri yerleştirin ve hücrelerin yeni sentezlenen mRNA'yı dışarı aktarmasına izin verin. Tek bir iğne, birden fazla lameli enjekte etmek için yeniden kullanılabilir. Ancak, mikroenjeksiyon yapılan DNA veya RNA tipi değiştiğinde iğnenin değiştirilmesi gerekir.

Ayrıca, iğne wand'dan çıkarıldıktan sonra, mRNA nükleer dışa aktarım kinetiğinin doğru bir ölçümünü elde etmek için imha edilmelidir. Ayrı örnekler sıfırıncı dakikada, 15. dakikada, 30. dakikada, 60. dakikada ve 120. dakikada fikse edilmelidir. Uygun zamanda alfa manin uygulamasının ardından, büyüme ortamını aspire edin ve hücreleri iki mililitre PBS çözeltisi ile iki kez yıkayın.

Lamel ve sıvı temasının kesildiği süreyi minimumda tutarak lamellerin nemli kalmasını sağlamak önemlidir. PBS içinde %4 Aldehit'ten iki mililitre ekleyerek hücreleri sabitleyin ve hücreleri oda sıcaklığında en az 15 dakika inkübe edin. Sabitlenmiş örnekleri iki kez daha yıkadıktan sonra, PBS içinde %0,1 Triton X 100'den iki mililitre ile hücreleri permeabilize edin; hücreleri tekrar oda sıcaklığında en az 15 dakika inkübe edin.

Son olarak, örnekleri hibridizasyona hazırlamak için iki kez daha yıkayın. Hücreleri, %25 ila %60 formamid içeren 1X SSC çözeltisinden oluşan bir yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Ardından, 150 mm'lik bir Petri kabının tabanını suyla kaplayıp üzerine bir parça parafilm yerleştirerek hibridizasyon için boyama hücresini hazırlayın.

Kabı ters çevirerek suyu uzaklaştırın, böylece paraformun kabın tabanına yapışması sağlanır. Boyanacak her bir lameldeki hava kabarcıklarını manuel olarak giderin. Paraform üzerine 100 µL hibridizasyon çözeltisi damlatın.

Formaj miktarının, kullanılan spesifik balık probu için pens yardımıyla optimize edilmesi gerektiğine dikkat edin. Sabitlenmiş hücrelerin bulunduğu lamelini 30 milimetrelik Petri kabından çıkarın. Watman filtre kağıdı kullanarak lamelin arka tarafını kurulayın ve hücreleri kurutmadan ön taraftaki fazla tampon çözeltiyi emdirin.

Ardından, lamelini yüzü aşağı bakacak şekilde balık solüsyonunun üzerine yerleştirin. Bu işlemi her bir lamel için tekrarlayın. Boyama odacıklarının kapağını geri kapattıktan sonra, örnekleri 37 °C'de 5 ila 18 saat boyunca inkübe edin.

Boyama odasının hazırlandığı yöntemle birkaç yıkama odası hazırlayın; her bir lamellenin üzerine yıkama odasındaki paraformun üzerine bir mililitre yıkama tamponu pipetleyin. İnkübasyonun ardından, bir mililitre yıkama tamponu pipetleyerek lamelleri boyama odasından çıkarın. Sıvı, kılcal etkileşimle her bir örneğin altına çekilmelidir.

Ardından, lamel camlarını pensle çıkarın ve her birini beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilmiş bir damla yıkama tamponu üzerine yerleştirin. Her bir lamel camını iki kez daha yıkayarak toplamda üç yıkama gerçekleştirin; önceden yıkanmış bir lam üzerine pens ve watman filtre kağıdı kullanarak dappy içeren 10 ila 30 µL montaj solüsyonu damlatın. Her lam iki lamel camı alabilir.

Lamellerin arka yüzeylerini kurulayın ve numuneleri kurutmadan lamellerin ön yüzündeki fazla sıvıyı emdirerek alın. Her bir lameli, yüzeyi aşağı bakacak şekilde bir damla montaj çözeltisinin üzerine yerleştirin. Monte edilmiş numuneler dört degrees Celsius sıcaklıkta saklanabilir.

Burada, farklı konsantrasyonlarda alfa mantin ile ön işlem uygulanmış NIH 3T3 fibroblast hücrelerinde, alfa mantinin enjekte edilen plazmid DNA transkripsiyonu üzerindeki etkileri gösterilmiştir. Hücrelere TFL s delta i plazmid DNA ve OG konjuge 70 kilo dalton dekstran enjekte edilmiştir. Her satır, OG 70 kilodalton dekstran ve T uts delta I mRNA için görüntülenen tek bir görüş alanına karşılık gelmektedir.

İlacın yüksek konsantrasyonlarının T UTS delta I transkript üretimini tamamen inhibe ettiği, düşük konsantrasyonlarda ise bunun gözlemlenmediği açıktır. Gösterilmiştir. Burada mRNA nükleer ekspor maliyetinin zaman seyri yer almaktadır. Yedi hücreye T UTS delta i plazmid DNA'sı ve OG konjuge 70 kilodalton dekstran enjekte edilmiştir.

Enjekte edilen hücreler, 30 dakika sonra alpha mantin ilele işlem görmüş ve 37 °C'de sırasıyla 0 dakika, 60 dakika ve 120 dakika boyunca inkübe edilmiştir. Hücreler daha sonra fikse edilmiş ve T UTS delta I mRNA'ya karşı bir prob ile ER markörü trap alpha'ya karşı antikorlar ile boyanmıştır; her satır tek bir hücre alanına karşılık gelmektedir.

mRNA ihracatının nasıl nicelendirileceğine dair bilgi için lütfen buradaki çevrimiçi metne bakın. 120. dakika zaman noktası büyütülmüştür. TFS delta I mRNA'sının ER'deki kolokalizasyonunu göstermek için, yeşil renkteki T UTS delta I mRNA ve kırmızı renkteki trap alfa'nın üst üste bindirilmiş görüntüsü gösterilmiştir. mRNA'nın proteinlerle nasıl beraber boyanacağına dair bilgi çevrimiçi metinde bulunabilir.

Size mikroenjeksiyon yoluyla mRNA'nın nükleer ekspor kinetiğinin nasıl ölçüleceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, başarılı bir mikroenjeksiyonun uygun hazırlık gerektirdiğini unutmamak önemlidir. DNA ve RNA örneği hazırlama, iğne çekme, optik ekipmanların hizalanması ve mikroenjeksiyon sorun giderme gibi temel adımlar yazılı protokolümüzde açıklanmıştır.

Mikroenjeksiyonla aktarılan mRNA görüntülenirken ve analiz edilirken, nicelleştirmenin, enjekte edilen sıvının %90'ından fazlasını çekirdeğe alan hücrelerle sınırlandırılması önemlidir. Başarılı bir çekirdek enjeksiyonu, organ green dekstranın çekirdek ve sitoplazmadaki dağılımı görselleştirilerek değerlendirilebilir. Balık problarının tasarımı ve mRNA'nın sitoplazma ile çekirdekteki dağılımını analiz etmek için görüntü analiz yazılımının kullanımı hakkında daha fazla bilgi için lütfen çevrimiçi protokolümüze bakınız.

Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.