Viral Patojenler Klinik Örnekler Ekranına bir Pan-Viral Mikroarray Testi (Virochip)

Bu prosedür, klinik örnekleri hem bilinen hem de bilinmeyen virüsler açısından analiz etmek için pan viral bir mikroarray testi olan Viro çipi kullanır. İlk olarak, klinik örneklerden nükleik asitler ekstre edilir. Ardından, ekstrakte edilen RNA, rastgele primerler kullanılarak ters transkripsiyona uğratılır.

İkinci zincir CD NA sentezi gerçekleştirilir ve CD NA kütüphanesi rastgele PCR ile çoğaltılır. Ardından, çoğaltılmış cd NA floresan boyalarla işaretlenir ve viral çip mikroarray'ine hibridize edilir. Son adım, mikroarray'in taranması ve analiz edilmesidir.

Nihayetinde, çip mikroarray analiz yoluyla bir virüsün veya birden fazla virüsün varlığı veya yokluğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Viral çip mikroarray gibi geniş spektrumlu tespit yöntemleri diyagnostik mikrobiyolojide gereklidir; çünkü pnömoni gibi yaygın klinik sendromlar herhangi bir tekil patojene özgü değildir ve SARS Koronavirüs ile 2009 yeni H1N1 influenza virüsü gibi sürekli ortaya çıkan yeni viral patojen tehditleri söz konusudur. Bu yöntem, klinik ortamdaki tanı konulmamış enfeksiyonların yüzde kaçının henüz tanımlanmamış yeni virüslerden kaynaklanabileceği gibi, diyagnostik mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Yüzlerce hatta binlerce potansiyel patojeni eş zamanlı olarak test ettiğimiz için, bu tekniğin etkileri hastanedeki akut klinik hastalıkların daha iyi teşhis edilmesine kadar uzanmaktadır.

Bu yöntemle ilgili fikrimiz ilk olarak, UCSF'de Dr. Joseph DeRisi'nin laboratuvarında öncülük edilen yeni geliştirilmiş mikro-diziler teknolojisini virüslerin tespitine uygulama kararı aldığımız 2002 yılında ortaya çıktı. İlk gerçek dünya test vakamız, 2003 yılında SARS'tan sorumlu yeni bir koronavirüsü tanımlamak için viral çip kullanmaktı; prosedürün başından sonuna kadar gösterimi, bir çocuğun akut solunum yolu hastalığının nedenini teşhis etmek için bir nazal sürüntü örneği üzerinde viral çip analizinin kullanımını gösterecek olan laboratuvarımdan bir teknisyen tarafından gerçekleştirilecektir. Nazofaringeal sürüntü örnekleri, viral taşıma sıvı ortamı içeren steril kaplarda toplanır ve -80 °C dondurucuda donmuş halde saklanır.

Bir biyogüvenlik kabininde, numuneyi içeren tüpün çözülmesini bekleyin ve pamuklu çubuğu biyotehlikeli atık kutusuna atmadan önce besiyeri içinde kısa bir süre karıştırın. Ardından, numuneden 200 µL alarak 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Viral partikülleri saflaştırmak için numuneyi 0,22 µm'lik bir santrifüj filtreden geçirerek yeni bir 1,5 mL'lik tüpe aktarın.

Ardından, konak genomik DNA'sını degrade etmek ve korumalı kapsüllenmiş viral nükleik asidi saflaştırmak için üretici talimatlarına uygun olarak Ambien marka Turbo DNA kitini kullanın. Bunu, üretici talimatlarına uygun olarak XMO ZR viral RNA ekstraksiyon kiti veya Qiagen ultrasound virus kiti ile RNA ekstraksiyonu yaparak takip edin. Ekstre edilen RNA'nın konsantrasyonunu NanoDrop nükleik asit spektrofotometresi kullanarak ölçün.

RNA konsantrasyonunun tercihen mikrolitre başına en az 10 ng olması önerilir, ancak ince duvarlı 200 µL'lik tüp kullanıldığında bu değer örnekten örneğe farklılık gösterecektir. Ekstrakte edilen 4 µL RNA'ya, 40 pmole/µL konsantrasyonda 1 µL primer A ekleyin. Örneği bir termosiklet cihazında beş dakika boyunca 65 °C'ye ısıtın ve ardından tüpün beş dakika boyunca oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.

Ardından, bir termosiklet cihazında; iki mikrolitre 5x RT tamponu, bir mikrolitre 12.5 mM dNTP, bir mikrolitre su, 0.5 mikrolitre 0.1 M DTT ve 0.5 mikrolitre ters transkriptaz içeren beş mikrolitrelik bir master mix ekleyin. Tüpü 42 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra örneği 94 °C'de iki dakika boyunca ısıtın.

Ters transkriptaz reaksiyonunu durdurmak için, iki dakika boyunca 10 °C'ye çağırın ve beş saniye boyunca kısa süreli santrifüj yapın. Ardından; 1 µL 5x quease tamponu, 3,8 µL su ve 0,15 µL quease ikinci zincir sentezinden oluşan beş mikrolitre quease karışımı ekleyin. Termosiklörü sekiz dakika içinde 10 °C'den 37 °C'ye yükseltin.

37 °C'de sekiz dakika boyunca bekletin. Ardından, kuazı inaktive etmek için 94 °C'de iki dakika boyunca ısıtın ve bu noktada 10 °C'ye soğutun. İsteğe bağlı olarak, 15 µL cDNA içeren örneği -20 °C'de saklayın.

İlk olarak, beş µL CD NA örneğini; beş µL 10x PCR tamponu, bir µL 12,5 mM dNTP, bir µL 100 pmol/µL primer B, bir µL cleantech LA ve 37 µL sudan oluşan 45 µL'lik bir master mix'e ekleyin. Ardından, PCR protokolünü şu şekilde uygulayın: iki dakika boyunca 94 °C, ardından 25 döngü boyunca 30 saniye 94 °C, 45 saniye 50 °C ve bir dakika 72 °C.

Ardından beş dakika boyunca 72 °C'de bir uzama aşaması ve PCR sonrası 10 °C'de bekletme uygulanır. PCR ürünü %1,5'lik agarose elektroforez jeli ile kontrol edilir. Yaklaşık 200 ile 1000 baz çifti arasında bir yayılma (smear) görülmelidir.

AAD DNTP eklemek için, beş mikrolitre viral PCR ürününü; beş mikrolitre 10 kat PCR tamponu, bir mikrolitre 12,5 milimolar A-A-D-N-T-P, bir mikrolitre 100 p çoklu mikrolitre primer B, bir mikrolitre ClinTech LA ve 37 mikrolitre sudan oluşan 45 mikrolitrelik bir master mix'e ekleyin. PCR protokolünü şu şekilde uygulayın: iki dakika boyunca 94 degrees Celsius, 94 degrees Celsius'te 30 saniye ve 50 degrees Celsius'te 45 saniyeden oluşan 15 döngü.

Bir dakika boyunca 72 °C'de, ardından beş dakika boyunca 72 °C'de bir bekletme adımında ve 10 °C'de tutun. Daha sonra yeni PCR ürününü, üretici talimatlarına uygun olarak DNA clean and concentrator three kiti ile temizleyin ve 10 µL elüsyon tamponunda çözün. 10 µL'lik PCR ürününe bir µL 1 M bikarbonat ve bir µL si three ekleyin ve karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin.

Ardından, S işaretli örneği tekrar DNA clean and concentrator five kiti ile temizleyin ve 12 µL elüsyon tamponunda elüye edin. Bir PCR şerit tüpünde, 1 µL 25x fragmantasyon tamponu, 5 µL 5x bloklama tamponu, 9,5 µL veya S I 3 işaretli örneğin 10 pM/µL normalize edilmiş final konsantrasyonu için gerekli miktar ve toplam hacmi 25 µL'ye tamamlayacak kadar su ekleyerek, cDNA konsantrasyonunu ve eklenen boya miktarını bir NanoDrop spektrofotometrede kontrol etmek için 1,5 µL örnek kullanın. Sonra 25 µL 2x GX hibridizasyon tamponu ekleyin ve kabarcıkları gidermek için kısa süre santrifüjleyin.

Hibritleşme haznesine yeni bir conta lamı yerleştirin. Conta lamının üzerine 40 µL örnek yükleyin. Ardından, Agilent işaretli tarafı aşağı gelecek şekilde Agilent basılı viral diziyi conta lamının üzerine yerleştirin ve vidayı sıkıca sabitleyin.

Hibridizasyon odasını 65 °C'lik bir fırına yerleştirin ve dizileri yıkamak için dakikada 10 devir hızında yavaş rotasyon uygulayarak gece boyunca hibridize edin. İlk olarak, ısıtma işlemi sırasında tampon iki'yi 37 °C'ye ön ısıtmaya tabi tutun. 500 mL'lik plastik bir kabı yaklaşık 250 mL tampon bir ile doldurun.

Diziyi hibridizasyon odasından çıkarın, diziyi daldırın ve conta lamdan ayırın. Diziyi temiz bir kaba aktarın ve bir dakika boyunca birinci tamponla yıkayın. Ardından, ayrı bir 500 mililitre plastik kap kullanarak işlemi sürdürün.

Diziyi, önceden ısıtılmış tampon iki içerisinde bir dakika boyunca yıkayın. Yıkama işleminden sonra, kabarcık oluşmamasına dikkat ederek diziyi tampon ikiden yavaşça çıkarın.

Dizinin aktif tarafına doğrudan dokunmamaya dikkat ederek, fazla nemi almak için bir kim wipe kullanın. Son olarak, lamı Agilent tarafı yukarı gelecek şekilde lam tutucuya yerleştirin ve dizi tarayıcısına yerleştirin. Bu prosedürde, bir Agilent iki mikron DNA mikro-dizi tarayıcısı kullanıyoruz.

Cihazın standart tarama protokolüne uygun olarak, etiketlenmiş üçlü diziyi beş mikron veya iki mikron seviyesinde tarayın. Viral çip mikro-dizilerini, küme analizi veya otomatik RO çip analiz programı e unpredic ile analiz edin. Viro Chipp mikro-dizisi kullanılarak, influenza benzeri hastalığı olan bir çocuktan alınan nazal sürüntü örneğinde 2009 yeni influenza H1N1 virüsü kolayca tespit edilmektedir.

Ek olarak, viral çipin yalnızca solunum yolu virüslerini değil, aynı zamanda çeşitli farklı doku ve vücut sıvılarından gelen geniş bir virüs yelpazesini tanımlayabildiğini gösterdik. Burada gösterildiği üzere, vichi kullanılarak tam kan ve serumda gerçekleştirilen bazı virüs tespit örnekleri yer almaktadır. Bunlar; her bir örnek için dört hastadan alınan tam kan veya serum kan örneklerinden elde edilen viro çip mikro-dizilerine karşılık gelen sonuçlardır; en düşük P değerine sahip olan en üstteki virüs tahminiyle birlikte, ilk iki virüs tahmini gösterilmiştir.

Örneğin, açık maviyle vurgulanan örnekte, o örnek için en üst sıradaki tahmin dengue virüsü tip bir'dir. İkinci sıradaki tahmin dengue virüsü tip iki olsa da, bu tam kan örneğindeki gerçek virüsün, dict sonuçlarıyla uyumlu olarak gerçekten dengue virüsü tip bir olduğu doğrulanmıştır. Viro chipin bir başka uygulama alanı ise yeni patojenlerin keşfidir.

Bazı örnekler arasında sars koronavirüsü X-M-R-V-A, insanlarda prostat kanseri ve kronik yorgunluk sendromu ile bağlantılı OME retrovirüsü ve çocuklarda solunum yolu ve ishal enfeksiyonları ile ilişkili yeni bir insan kardiyovirüsü olan HTCV'nin keşifleri yer almaktadır. Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, uygun şekilde uygulandığında 12 saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, gerekli tüm ekipman ve reaktiflerin hazır olduğundan emin olunması önemlidir.

Sıradışı viral çip hibridizasyon modellerini veya geliştirilmesinden sonra yeni bir virüsün varlığını düşündüren viral çip sonuçlarını doğrulamak ve takip etmek amacıyla, spesifik viral PCR amplifikasyonu ve derin sekanslama gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik; onkoloji alanındaki araştırmacıların yeni virüslerin kanserle olan ilişkisini araştırmalarına, biyosavunma ve klinik mikrobiyoloji alanlarında hızlı patojen teşhisi için yoğunlaştırılmış mikro tabanlı analizler geliştirmelerine ve viroloji alanında yeni virüslerin karakterizasyonu ile hastalıklarla ilişkilerini belirlemelerine olanak sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, klinik örneklerde viral patojenleri tespit etmeye yönelik geniş spektrumlu bir sürveyans testi olan viral çip mikroarray analizinin; klinik örneklerden nükleik asit ekstraksiyonundan başlayıp mikroarray hibridizasyonu ve analizine kadar olan tüm adımlarının nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Klinik örneklerle çalışmanın biyotehlikeli olarak kabul edildiğini ve nükleik asit ekstraksiyonunun biyogüvenlik seviyesi iki veya daha yüksek olan laboratuvarlarda gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın.