Clonogenic Testi: yapışkan Hücreler

Merhaba, benim adım Lum ve şu anda Epigenomik Tıp Laboratuvarı'nın başkanı olan Dr. Tom Carianne'in danışmanlığında BE IDI Kalp ve Diyabet Enstitüsü'nde doktora çalışmalarımı yürütüyorum. Bu videoda, Klonojenik Sağkalım Analizi olarak bilinen prosedürü göstereceğim. Bu, radyasyona veya kimyasal ajanlara maruz kalma gibi farklı tedavilerin hücresel reprodüktif canlılık üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesine olanak tanıyan 50 yıllık bir tekniktir.

Konjenik sağkalım analizi, farklı hücre hatlarının radyasyon duyarlılığını değerlendirmek ve farklı radyoprotektif veya radyosensitize edici bileşiklerin etkinliğini test etmek için radyasyon biyolojisinde kullanılan temel bir tekniktir. Adherent bir hücre hattı kullanıldığında, kriyojenik sağkalım analizi üç aşamadan oluşur. İlk olarak, adherent hücrelerin monokatmanının uygulanacak işleme tabi tutulması.

İkinci olarak, tek hücre süspansiyonunun hazırlanması, bilinen sayıda hücrenin ekilmesi ve kapların boyanması; üçüncü olarak ise boyama, sayım ve bir inkübasyon süresinin ardından oluşan kolonilerin değerlendirilmesi işlemleri gerçekleştirilir. Bu videoda, doğal bir antioksidanın radyoprotektif özelliklerini belirlemek için poligenik Bible assay yönteminin nasıl kullanılabileceğini göstermek amacıyla ölümsüzleştirilmiş insan sinosit hücrelerini kullanacağım. Deney gününde flask başına 1 milyon hücre olması için, önceden beş ml besiyeri içeren 25 ml'lik flasklara hücreler ekilmiştir.

Gerekli konsantrasyonu elde etmek için, uygun şekilde etiketlenmiş her bir flasktaki beş ml besiyerine farklı konsantrasyonlarda 50 µL ilaç eklenir; bu durumda beş farklı konsantrasyonun yanı sıra araç kontrol olarak PBS kullanılır. İlaç eklendikten sonra hücreler, kullanılan hücre hattı için uygun koşullarda bir saat boyunca inkübe edilir. İnkübasyon sonrası, kontrol grubu hariç tüm flasklar, bu örnekte gama ışını yayan bir sezyum kaynağı tarafından üretilen dört Gy seçilen dozda ışınlanır.

Işınlama sonrası, besiyerleri dökülür ve her bir flask beş dakika boyunca iki ml PBS ile yıkanır. PBS döküldükten sonra, flasklara yapışmış hücreleri ayırmak için her bir flaska iki ml %0,05 tripsin eklenir. Ardından, tripsini inaktive etmek için her bir flaska %10 fetal bovine serum içeren beş ml DMEM eklenir.

Ardından, flask içeriğinin tamamı etiketlenmiş 10 mililitrelik falcon tüplerine aktarılır. İşlem tamamlandığında, bu tüpler beş dakika boyunca santrifüj edilir; sonrasında süpernatant, pelleti rahatsız etmeden dikkatlice uzaklaştırılır ve her tüpe beş mililitre crecy medyumu eklenir. Her örnek için hücre konsantrasyonu hesaplanır ve her örnekten, her biri beş mililitre medyum içeren örnek başına beş Petri kabına ekilecek hücrelerin nihai konsantrasyonuna ulaşmak için gereken hacim belirlenir.

Örneğin, kontrol grubu için kap başına 100 hücre ekilir; bu nedenle, 25 mililitrede 500 hücreye ulaşmak için gereken hacim hesaplanır. Daha konsantre örnekler için, 100 mikrolitrenin altındaki hacimler kullanılırken oluşabilecek hataları en aza indirmek amacıyla 10 kat seyreltme veya 100 kat seri seyreltme işlemi gerçekleştirilir. Ardından, her örnek için önceden hesaplanan hacim, 25 mililitre besiyeri içeren bir Falcon tüpü içerisinde hazırlanır. Örnekler, daha kolay taşıma ve işlem yapabilmek adına her bir kaba beş mililitre eklenecek şekilde, önceden etiketlenmiş kaplara aktarılabilir.

Kapları büyük, steril veya dezenfekte edilmiş bir kapta saklayın. Kaplar daha sonra uygun koşullarda nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirilir ve sekiz gün boyunca inkübe edilir. Sekiz gün sonra keratinositler kullanılacaksa, kapları dikkatlice inkübatörden çıkarın ve bir çeker ocak içerisinde her birini tek tek yan yana dizin.

Oluşmuş olan kolonilerin bozulmaması için plağı nazikçe tutmaya dikkat edin. Kapakları çıkarın ve yıkama yapmak için her bir kaba beş ml %0.9 saline ekleyin. Hazırlama ucunu kabın köşesine doğru yönlendirin ve kolonilerin yanlışlıkla sıyrılıp kalkmasını önlemek için kabın tabanına değdirmekten kaçının.

Beş dakika sonra, salini dikkatlice aspire edin. Şimdi, koloniler 3 mL %4'lük formül ile fikse edilir ve buharlaşmayı önlemek için kapaklar kapatılmalıdır. 15 dakika ile yarım saat arasında, formül aspire edilir ve uygun şekilde imha edilir.

Koloniler artık %0,1 Kristal viyole ile boyanmaya hazırdır; her bir petriye beş mililitre eklenir ve yarım saat ile bir saat sonra kapaklar kapatılır. Ardından boya, distile su ile yıkanarak temizlenir, petri kapları ters çevrilir ve gece boyunca kurumaya bırakılır. Koloniler artık sayılmaya hazırdır.

Koloniler, bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak manuel olarak sayılabilir. 50 veya daha fazla hücre içeren her hücre kümesi bir koloni olarak kabul edilir. Böylece Konjenik sağkalım testi gösterimimizi tamamlamış olduk.

Bu analizin diğer tekniklere göre temel avantajı, inanılmaz derecede hassas olması ve altı logluk hücre ölümü sonrası bile geniş bir aralıktaki sağkalımı tespit edebilmesidir. Bu hassasiyet, daha fazla sayıda hücre ekilerek sağlanır. Bu analiz, sitotoksisite testi gibi diğer amaçlar için de kolaylıkla kullanılabilir.

İzlediğiniz için teşekkürler.