Co-uyarıcı Sinyal Abluka Alloantigen Uyarım İnsan periferik kan mononükleer hücreleri içinde Alloantigen özel anerji indüksiyonu

Aşağıdaki deneyin genel amacı, antijen sunan hücrelerin T hücreleri üzerindeki CD 28 reseptörü aracılığıyla ko-stimülasyonunu engelleyen antikorların varlığında, alıcı allo antijenleri ile ex vivo stimülasyon yaparak alıcı allo-spesifik donör T hücrelerini enerjize etmektir. Bu işlem, öncelikle iki farklı sağlıklı donörden PBMC izole edilerek gerçekleştirilir. Ardından, CD 28 stimülasyonunu engellemek için B 7.1 ve B 7.2 ligandlarına karşı monoklonal antikorların varlığında, HLA uyumsuz PBMC popülasyonları inkübe edilerek toplu bir allo enerjize edici ko-kültür kurulur.

Ardından, allo enerjizasyonun etkinliği, primer ve sekonder karışık lenfosit reaksiyonları (MLR) ile ölçülür. Son olarak, allo enerjizasyonun allo spesifisitesi, üçüncü taraf ve CMV spesifik yanıtlar belirlenerek ölçülür. Elde edilen sonuçlar, donör T hücrelerinin sonraki allo antijenik stimülasyona karşı hipo-responsif hale geldiğini, ancak allo-reaktif olmayan donör T hücrelerinin bozulmadan ve fonksiyonel kaldığını göstermektedir.

HLA uyumsuz kök hücre transplantasyonu sırasında ve sonrasında allo enerjize donör T hücrelerinin infüzyonuna ilişkin önceki ve devam eden pilot klinik çalışmalarda bu stratejiyi başarıyla uyguladık; manipüle edilmemiş HLA uyumsuz transplantasyon alan alıcıların tarihsel kontrollerine kıyasla gelişmiş immün rekonstitüsyon, daha az enfeksiyon ve daha hafif seyreden akut ve kronik graft versus host hastalığı gözlemledik. Allo anodizasyon stratejisinin temel bir avantajı, tekniğin patojen spesifik veya tümör ilişkili antijen spesifik T hücre yanıtlarını azaltmaması veya donör T hücre havuzundan CD four düzenleyici T hücrelerini elimine etmemesi nedeniyle hedef dışı etkilerin minimize edilmesidir; bu da prosedürün etkinliğini kanıtlamaktadır. Laboratuvarımızdaki uzman bilim insanı Christine Vin, işlemi gerçekleştirecek. İlk adım, iki sağlıklı gönüllü donörden kan almaktır.

Bir donörden alınan hücreler yanıtlayıcı, başka bir donörden alınan hücreler ise stimülatör olarak hizmet edecektir. Ardından, fial pac kullanarak yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile kandan PBMC izole edin. Trian blue ile küçük bir miktar hücreyi boyayın ve hemo cytometer reus kullanarak canlı PBMC'leri sayın.

Her donörden alınan PBMC'leri, ayrı 15 mililitrelik konik tüplere mililitre başına 1 milyon canlı hücre konsantrasyonunda 10 mililitre tamamlanmış kültür ortamı ile dağıtın. Toplu allo-enerjize edici ko-kültürü kurmak için donör PBMC tüplerinden birini stimülatör, diğerini ise yanıtlayıcı olarak belirleyin.

Stimülatör olarak belirlenen 15 mililitrelik tüpe 100 mikrogram anti B 7.1 ve anti B 7.2 antikoru ekleyin. Tüpü nazikçe çalkalayın ve 30 dakika boyunca inkübe edin; inkübasyon süresi dolduktan sonra, stimülatör PBMC'leri ışınlayın ve gaz geçirgen kapaklı bir T 25 50 kübik santimetre hücre kültür balonu içerisine aktarın.

Balonu "bulk allo coal kültürü" olarak etiketleyin. Ardından, diğer donörden alınan, tam besiyerinde mililitrede 1 milyon hücre konsantrasyonundaki 10 mililitre yanıtlayıcı PBMC'yi balona ekleyin. Balona ayrıca antib 7.1 ve Antib 7.2 antikorlarının her birinden 100 mikrogram ekleyin ve balonu 72 saat boyunca bir inkübatöre dik olarak yerleştirmeden önce nazikçe karıştırın.

Ardından, bloklayıcı antikorlar olmadan yapılacak bir kütle kontrol ko-kültürü için 10 milyon stimülatör PBMC'yi daha ışınlayın ve bunları bir T 25 50 cubic centimeter hücre kültürü flaskına ekleyin. Flaskı "kütle kontrol ko-kültürü" olarak etiketleyin. Kütle allo-enerjize edici ko-kültürü için kullanılan responder PBMC'lerin 1 milyon/ml konsantrasyonda 10 mililitresini komplet medyada flaska ekleyin ve flaskı 72 saat boyunca bir inkübatöre dik olarak yerleştirmeden önce nazikçe karıştırın.

Bir sonraki adım, toplu ko-kültürlerin etiketlendiği gün, allo-enerjize donör T-hücresi havuzunun fonksiyonunu ölçmektir. Ölçülecek üç zaman noktasının her biri için U tabanlı 96 kuyucuklu plakaya primer MLR hazırlayın. Ardından, toplu kontrol ve allo-enerjize ko-kültürlerin her birinden beş mililitreyi 15 mililitrelik tüplere aktarın.

Ardından, her tüpten 200 µL hücre süspansiyonunu üç plakanın her birindeki triplicate kuyucuklara pipetleyin. Toplu kontrol soğuk kültürlerinden gelen hücreler için bu kuyucukları "kostimülatuvar blokaj yok" veya "no CSB", toplu allo enerjize soğuk kültürlerinden gelen hücreler için ise "CSB" şeklinde etiketleyin. Daha sonra, negatif kontroller olarak her plakadaki altı kuyucuğa 200 µL komplet medya ekleyin.

Son olarak, buharlaşmayı azaltmak için tüm boş kuyucuklara 200 µL PBS ekleyin ve plakaları inkübatöre yerleştirin; toplu ko-kültürlerin kurulumundan 72 saat sonra, ölçülecek üç zaman noktası için birer adet UBO 96 kuyucuklu plakayı sekonder MLR olarak etiketleyin. Sekonder MLR için yanıtlayıcı hücreleri hazırlamak amacıyla, her bir toplu kontrol ve allo-enerjize ko-kültürden 5 mL'yi 15 mL'lik tüplere aktarın ve tüpleri oda sıcaklığında 2000 RPM'de 5 ila 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, SN'leri dikkatlice aspire ederek, pelletleri dağıtarak, her tüpe 10 mL komple medya ekleyerek hücreleri iki kez daha yıkayın ve ikinci yıkamadan sonra hücreleri tekrar santrifüjleyin.

Hücreleri 1 mL tam besiyerinde tekrar süspande edin. Canlı hücreleri saymak için tripan mavisi boyama kullanın ve hücre konsantrasyonunu mililitre başına 1 milyon canlı yanıtlayıcı hücre olacak şekilde ayarlayın. Her tüpten 100 µL hücre süspansiyonunu, her plakanın üç tekerrurlu kuyucuklarına pipetleyin.

Bu kuyucukları önce birinci taraf veya FP alaoy stimülasyonu olarak etiketleyin. Ardından, her tüpten 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu her plaktaki diğer üç kuyucuğa pipetleyin ve bu kuyucukları, allo için birinci taraf stimülatör PBMC'lerini sağlamak amacıyla kullanılan aynı donörden gelen CD 3/28 stimülasyonu PBMC olarak etiketleyin. Enerjize edilmiş ve kontrol ko-kültürleri, sekonder MLR için stimülatör hücreler olarak kullanılır; birinci taraf donör PBMC'lerinden 10 milyonu, 1 milyon/ml konsantrasyonda süspande edin ve iradyasyon ekleyin.

Her bir sekonder MLR plakasında fp allo restimulation olarak etiketlenmiş kuyucuklara 100 µL ışınlanmış stimülatör hücre ekleyin. Pozitif kontroller için, her bir sekonder MLR plakasında CD 3 28 stimulation olarak etiketlenmiş kuyucuklara birer µL CD3 ve CD28 monoklonal antikorları ile 98 µL komple besiyeri ekleyin. Ayrıca, negatif kontrol olarak hizmet etmesi için her plakada altı boş kuyucuğa 200 µL komple besiyeri ekleyin ve buharlaşmayı azaltmak için tüm boş kuyucuklara 200 µL PBS ekleyin.

Plakaları inkübatöre yerleştirin. Bir sonraki adım, üçüncü taraf donör olarak adlandırılan yeni bir sağlıklı donörden izole edilen allo PBMC'lerin özgüllüğünü ölçmektir; bunlar, ikincil bir MLR'de allo sürecinin özgüllüğünü test etmek için kullanılır. Üçüncü taraf PBMC'lerini mililitre başına 1 milyon hücre olacak şekilde süspande edin ve 3 adet 96 kuyucuklu plağı "secondary MLR specificity day three, five and seven" şeklinde etiketleyerek ışınlayın.

Özgüllüğü ölçmek amacıyla ikincil MLR için yanıtlayıcı hücreleri hazırlamak için, bulk kontrol ve allo enerjize eden ko-kültürlerin her birinden beş mililitreyi 15 mililitrelik tüplere aktarın ve tüpleri 2000 RPM'de beş ila 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, süpernatanları dikkatlice aspire ederek, peletleri dağıtarak, her tüpe 10 mililitre komple besiyeri ekleyerek ve ikinci yıkamadan sonra hücreleri tekrar santrifüjleyerek hücreleri iki kez yıkayın. Hücreleri bir mililitre komple besiyeri içinde yeniden süspande edin.

Hücreleri saymak için trypan blue boyaması yapın ve hücre konsantrasyonunu mililitre başına 1 milyon canlı yanıtlayıcı hücre olacak şekilde ayarlayın; ardından her tüpten 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu her plaktaki üç tekrarlı kuyucuklara pipetleyin. Bu kuyucukları TP veya üçüncü taraf allo stimülasyonu olarak etiketleyin. Daha sonra TP allo stimülasyonu olarak etiketlenen kuyucuklara 100 mikrolitre ışınlanmış TP stimülatör hücreleri ekleyin.

Patojenlere karşı verilen allo yanıtların özgüllüğünü daha fazla test etmek için, CMV'ye karşı daha önce kurulmuş proliferatif yanıtları olan donörlerden alınan PBMC'lerin enerjize edilmesinin ardından ölçümler yapılır; 3 96 kuyucuklu plakaları "ikincil M-L-R-C-M-V gün üç, beş ve yedi" şeklinde etiketleyin ve toplu kontrol ile allo enerjize eden ko-kültürlerin her birinden 5 mL'yi 15 mL'lik tüplere aktarın. Ardından hücreleri yıkayın, sayın ve komple medyada 1 milyon/mL olacak şekilde resüspande edin; her tüpten 100 µL hücre süspansiyonunu her plakadaki üç kuyucuğa pipetleyin ve bu kuyucukları "CMV stimülasyonu" olarak etiketleyin.

Ardından, CMV stimülasyonu olarak etiketlenen kuyucuklara 100 µL tam besiyeri içinde 0,1 µL CMV lizatı ekleyin. Daha sonra, negatif kontroller olarak her plakta altı kuyucuğa 200 µL tam besiyeri ekleyin. Son olarak, buharlaşmayı azaltmak için tüm boş kuyucuklara 200 µL PBS ekleyin ve primer ve sekonder MLR'de proliferasyonu ölçmek için plakları inkübatöre yerleştirin.

Plakaların hasadından 16 saat önce, negatif kontrol ve hücre içeren kuyucuklara bir mikro Curie trityumlu timididin ekleyin. Bir TomTec hasat cihazı veya benzeri bir cihaz kullanarak her plaka için bir filtre matı üzerinde timididini toplayın. Filtre matlarını bir saat boyunca kurutun.

Ardından bunları ayrı örnek torbalarına yerleştirin. Her birine beş mililitre sintilasyon sıvısı ekleyin ve ağzını kapatın. HLA uyumsuz stimülatör ve responder PBMC kullanarak, filtre matlarını bir Wallach mikro beta sintilasyon sayacı veya benzeri bir cihazla okuyarak deneyin son 16 saatindeki tri-timidin inklüzyonunu ölçün.

Bu şekilde, primer MLR'de ko-stimülatuvar blokajın varlığının, yanıt veren PBMC'lerin beşinci gündeki ortalama allo proliferasyonunu, ko-stimülatuvar blokajın olmadığı kontrol primer MLR'de görülenin yaklaşık %30'una düşürdüğü görülebilir. Bu durum, beşinci günde primer allo proliferasyonunun yaklaşık %70'lik bir ortalama inhibisyonuna eşdeğerdir. Bu şekilde görüldüğü gibidir.

Bu şekilde, ikincil MLR'de beşinci gündeki birinci parti allo proliferasyonunun, kontrol PBMC ile görülenin tipik olarak %10 ila %15'i olduğu görülebilir. Bu durum, %85 ila %90'lık bir ortalama proliferasyon inhibisyonuna eşdeğer olup, allo enerjize edilmiş PBMC'lerin birinci parti allo stimülatörlere karşı hipo-responsif olduğunu göstermektedir. Bu şekilde görüldüğü üzere, allo enerjize donör periferik kan mononükleer hücreleri için optimize edilmiş dökme ko-kültürler iki ila üç saat içinde kurulabilir.

Bu yaklaşım, allo-reaktivitesi azaltılmış ancak patojene özgü immünitesi korunmuş donör T hücreleri üretmek amacıyla klinik kullanım için kolayca standardize edilebilir. Bu hücreler, aşırı graft-versus-host hastalığına yol açmadan immün rekonstitüsyonu iyileştirmek için allojenik hematopoetik kök hücre transplantasyonu kapsamında adaptif olarak transfer edilebilir. Bu prosedür uygulanırken, hızlı çalışmanın önemli olduğu unutulmamalıdır.

Bu, hücrelerin canlılığının korunmasına yardımcı olur ve antijen sunan hücrelerin spesifik olmayan aktivasyonunu veya kaybını önler. Stimülatörler veya yanıtlayıcılar için kriyoprezerve PBMC kullanılıyorsa, dondurulmuş hücrelerin yeniden canlandırılması için tutarlı bir şekilde yüksek canlı hücre verimi sağlayan valide edilmiş bir protokol kullanılmalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, insan donör periferik kan mononükleer hücrelerinin nasıl allo-anize edileceği ve bu prosedürün etkinliği ile özgüllüğünü değerlendirmek için analizlerin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız; bu strateji, allojenik hematopoetik kök hücre transplantasyonu sonrası immün rekonstitüsyonu iyileştirmek için klinik olarak kullanılabilecek, azalmış allo yanıtlarına sahip insan donör T hücreleri üretmek için kullanılabilir.