Katı Plaka tabanlı Diyet Kısıtlama Caenorhabditis elegans

Bu prosedür, uzun ömürlülük, üreme ve metabolizma üzerindeki etkilerini incelemek amacıyla, deniz zarafetindeki standart tabanlı plaka üzerinde diyet kısıtlaması uygular. Bu işlem, öncelikle besin kaynağı olarak kullanılacak bakterilerin konsantrasyonunun hassas bir şekilde ölçülmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, bakteri kültürünün uygun konsantrasyonlarda doğru şekilde seyreltilmesidir.

Ardından, öldürülmüş bakteriler içeren tabanlı SDR plakaları hazırlayın. Son olarak, yaşları senkronize edilmiş bir solucan popülasyonu ile SDR deneylerini kurun. Döl üretimi ve yaşam süresi ölçümlerinin sonuçları, gecikmiş ve azalmış döl üretiminin yanı sıra artmış ortalama yaşam süresini gösterebilir.

Bu tekniğin AZA ortamındaki Dian gibi yöntemlere göre temel avantajı, tüm deneyin çoğu sıcak laboratuvar tarafından diyet kısıtlama deneyleri için kullanılan standart katı AGA tabanlı bir plak üzerinde gerçekleştirilecek olmasıdır ve her bir besin kaynağı olarak kullanılan bakteri suşu için ayrı kalibrasyon eğrileri oluşturulur. LB agardaki taze bir ekimden tek bir e coli OP 50 bakteri kolonisi seçin ve 37 °C'lik bir çalkalayıcıda gece boyunca üç mililitre sıvı LB besiyeri kültürüne inoküle edin. Gece boyunca inkübe edilen kültürün seri iki katlı dilüsyonlarını hazırlayın.

Ardından, her bir dilüsyonun absorbansını spektrofotometre ile 600 nanometrede üç tekrar halinde ölçün. Bakteriyel süspansiyonları daha fazla dilüsyone ederek, her bir dilüsyondan 0,4 mililitre bakteriyel süspansiyonu 100 milimetrelik LB agar plaklarına eşit şekilde ekin ve 37 °C'de 18 ila 24 saat boyunca inkübe edin. Her örnek için mililitre başına koloni oluşturan birim sayısını hesaplamak amacıyla her plakta büyüyen bakteri kolonilerini sayın.

Şimdi OD 600'ü bakteri konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak grafiğe dökün ve ölçülen OD 600 değerleri ile OP 50 bakteri konsantrasyonları arasındaki ilişkiyi belirlemek için doğrusal regresyon analizi gerçekleştirin. Bu yöntem için, ad lido besleme koşulunda mililitre başına 1 × 10¹¹ CFU, optimal DR besleme koşulunda ise mililitre başına 1 × 10⁸ CFU bakteri konsantrasyonu kullanılır. Bununla birlikte, tam bir doz bağımlı ilişki kurmak için dört ila altı farklı bakteri konsantrasyonuna ihtiyaç duyulabilir.

SDR ve yanıtları için. Tek bir e coli OP 50 bakteri kolonisi ile üç mililitre sıvı LB besiyerinde, 37 °C sarsıntılı inkübatörde altı ila sekiz saat boyunca kültüre ederek bir inokülüm hazırlayın. OP 50 kültürünü, 500 mililitre LB besiyeri içeren yeni bir erlene aktarın ve gerekirse bakterilerin doygunluğa ulaşması için gece boyunca büyütün.

OD 600 değerinde absorbans ölçümü için OP 50 kültürünün uygun seyreltmesini hazırlayın. Bakteri konsantrasyonunu belirlemek için bakterileri 1500 Gs'de 20 dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün. Süpernatantı uzaklaştırın ve bakterileri mililitrede 1 × 10¹² CFU konsantrasyonuna gelecek şekilde yeniden süspande edin.

Şimdi, mililitre başına 1 × 10¹² ile 1 × 10⁷ CFU arasında değişen altı farklı konsantrasyonda 10 mililitrelik bakteri kültürleri hazırlayın. 60 milimetrelik katılaştırılmış N GM plaklarının merkezine pipetle 0,2 mililitre bakteri kültürü ekleyin. Pipet ucunun plaka yüzeyine temas etmesinden kaçının; çünkü yüzeydeki çizikler, solucanların agar tabakasına gömülmesine neden olur.

Plakaları bir saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Ardından, bakterilerin büyümesini durdurmak için her plağa 10 µL 100 mg/mL carbonic soin ve 10 µL 50 mg/mL can mycin uygulayın. Farklı antibiyotik konsantrasyonlarıyla bakterileri öldürdüğünüz plakları, gelecekte kullanmak üzere bir aya kadar 4 °C'de saklayın.

Tüm bitki için tercihen aynı partiden olmak üzere yeterli miktarda plaka hazırlanması ve saklanması önemlidir. Bakterilerin canlılığını doğrulamak için en az bir ila iki gün önceden deney yapın. SDR plakalarından bir miktar bakteri kazıyın ve bunu karbonik, sein ve antimisin içeren boş bir N GM plakasına yayın.

Plakayı altı ila sekiz saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve bakteriyel büyüme olmadığını doğrulayın. Yaşam süresi analizi ve döl üretim profillemesi gibi SDR ile ilgili çalışmaların çoğunda, yaşları senkronize edilmiş bir solucan popülasyonunun hazırlanması esastır. 20 ila 30 adet reprodüktif olarak aktif yetişkini birkaç standart NGM plağına aktarmak için platin bir solucan toplama iğnesi kullanın.

OP 50 ile. Deneyler için gereken yumurta sayısına bağlı olarak, daha fazla yetişkin gerekebilir. Yumurta bırakılmasına izin vermek için plakaları 20 °C'de dört saat bekletin.

Yetişkinleri plakadan çıkarın ve plakaları yumurtalar açısından görsel olarak inceleyin. Yavruların geç L4 birincil yetişkin evresine gelmelerini sağlamak için plakaları 20 °C'de inkübe etmeye devam edin. 20 °C'de N2 yabani tip solucanlar için bu işlem genellikle üç gün sürer.

Ömür analizi için. Diyet kısıtlamasını başlatmak amacıyla 10 ila 12 günlük bir yetişkin solucanı bir SDR plakasına aktarın. Yeterli istatistiksel güce ulaşmak için, her SDR koşulu için toplam 60 ila 100 solucan kullanın.

Tüm solucanlar ölene kadar her iki ila üç günde bir her bir solucanın canlılığını puanlayın. Önemli bir nokta olarak, açlığı önlemek için solucanları gün aşırı taze SDR plaklarına aktarın. Bu kalibrasyon eğrisi, OP 50 konsantrasyonunu OD 600 ile ilişkili olarak grafikler.

Lineer regresyon analizi ile elde edilen denklem, gelecekteki tüm OP 50 bakteri konsantrasyonu hesaplamaları için kullanılabilir. Bu çalışma, kronik SDR tedavilerinin farklı solucan suşlarının ortalama yaşam süresi üzerindeki etkisini, vahşi tip solucanların SDR'ye verdiği normal doz bağımlı yanıtla karşılaştırarak incelemektedir. SDR'nin yaşam süresi üzerindeki etkisi, DR iki aşırı ekspresyonu ile kısmen baskılanırken, DAF 16 MU 86 mutasyonunun SDR kaynaklı yaşam süresi uzaması üzerinde hiçbir etkisi yoktur.

Bu videoyu izledikten sonra, sea elegance'daki standart AGA tabanlı oyunda Dian işleminin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.