Manyetik Rezonans Görüntüleme için hazırlanması, Saflaştırılması ve lantanide Kompleksleri Kontrast Ajanlar Kullanım Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, biyolojik makromolekülleri etiketlemek için kullanılabilecek lantanit içeren kompleksleri sentezlemek, saflaştırmak ve karakterize etmektir. Bu işlem, öncelikle çözeltinin pH değeri kontrol edilirken metal başlangıç maddesinin ve ligandın karıştırılmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, elde edilen kompleksin diyaliz kullanılarak saflaştırılmasıdır.

Ardından, serbest metal bulunmadığının doğrulanması gerekir. Prosedürün son adımı, kompleksin görüntüleme ile ilgili özelliklerinin karakterizasyonudur. Nihayetinde, relaksasyon aktivitesi ölçümleri aracılığıyla sentezlenen komplekslerin kontrast maddeler gibi davranacağını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, bir kontrast maddenin proteine bağlanmasıyla su koordinasyon sayısının değişip değişmediği gibi görüntüleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yönteme ihtiyaç duyan kişiler zorluk yaşayabilirler çünkü pH değerinin titizlikle kontrol edilememesi, LI'yı biyolojik eğitim için kullanışsız hale getirecektir. Diyaliz ve aktivite ölçümlerinin gösterimi Buda ve Sashi tarafından yapılacaktır.

Laboratuvarımdaki lisansüstü öğrenciler, lantanit tuzlarını kullanarak metilasyonu başlatmak için öncelikle bir eşdeğer ligandı, 30 ila 265 milimolar konsantrasyonda bir çözelti oluşturacak şekilde suda çözün. Burada Paraiso Benzyl DTPA ligandı 73 Millimolar konsantrasyonda kullanılmıştır. Ardından, bir molar amonyum hidroksit ekleyerek ligand çözeltisinin pH değerini 5.5 ile 7 arasına ayarlayın.

Bu videoda, bir molar amonyum hidroksit çözeltisinin 0.2 mililitresi kullanılarak, su içinde bir ila iki eşdeğer lantanit klorür çözülür ve böylece beş ila 1000 milimolar konsantrasyona sahip bir çözelti hazırlanır. 111 milimolar konsantrasyonlarda ya eurobiyum klorür ya da gadolinyum klorür kullanılabilir. Genellikle, çöktürmeyi tamamlamak ve sonuç olarak saflaştırmayı kolaylaştırmak için metal fazlası kullanılır.

Ardından, her bir lantan tuzları çözeltisini karıştırırken hazırlanan ligand çözeltisine ekleyin. Şimdi, 0,2 molar amonyum hidroksit ekleyerek ortaya çıkan reaksiyon karışımlarının pH değerini 5,5 ile yedi arasına ayarlayın. Burada, çözeltiyi ayarlamak için toplam 0,5 mililitre 0,2 molar amonyum hidroksit çözeltisi kullanılır.

Kullanılan ligand asit duyarlı fonksiyonel gruplar içeriyorsa, bu adım sırasında pH değerini birkaç kez ayarlayın. pH ayarı yaparken dikkatli olduğunuzdan emin olun; çünkü çözelti çok bazik hale gelirse, izotiyosiyanat gibi baz duyarlı fonksiyonel gruplar kullanılamaz hale gelecektir. Konjugasyon için reaksiyonu pH ölçümleri yoluyla yakından izleyin.

pH sabit kaldığında reaksiyon tamamlanmış olur. Baz hassasiyeti olan fonksiyonel grupları bulunmayan ligandlar için, pH'ın yükseltilmesini içeren bir işleme tabi tutma (workup) adımı da yararlı olabilir. Diyaliz işlemine başlamak için, numune hacmini alabilecek uygun uzunlukta bir diyaliz tüpü belirleyin ve numune hacminin ek %10'unu alacak şekilde fazladan uzunluk ekleyin. Ardından, tüpü bu uzunlukta kesmek için üretici kılavuzlarını takip edin.

Bu videoda 100 ile 500 Dalton moleküler ağırlık kesim noktasına sahip bir membran kullanılmıştır, ancak konjugasyon metilasyon öncesinde gerçekleştirilecekse uygun şekilde daha yüksek moleküler ağırlık kesim noktalı tüpler de kullanılabilir; üretici kılavuzlarına dayanarak, uygunsa, kesilmiş diyaliz tüpünü oda sıcaklığında 15 dakika boyunca suda bekletin. Ardından, diyalizat görevi görecek olan diyaliz rezervuarını suyla doldurun. Burada bir litrelik bir beher kullanılmıştır.

Diyalizat hacmi, numunenin yaklaşık 100 katı olmalıdır. Şimdi tüpün bir ucunu iki kez katlayın ve katlanan kısmı diyaliz kapatma klempi ile sabitleyin. Diyaliz sırasında kapalı kaldığından emin olmak için kapatılan ucu bir paket lastiği ile sarın.

Daha önce hazırlanan reaksiyon karışımını 0,2 mikronluk bir filtreden süzün. Ardından süzüntüyü tüpün açık ucuna yükleyin. Bu esnada tüpü yırtmamaya dikkat edin.

Tüpü kapatmak için yeterli boşluk bıraktığınızdan emin olun. Tüpün kalan açık ucunu iki kez katlayın, ardından bir kapatıcıyla sabitleyin ve kapatıcıyı bir paket lastiği ile sarın. Ardından, hava içeren bir cam şişeyi başka bir paket lastiği kullanarak diyaliz tüpünün bir ucundaki klemense tutturun.

Ardından, kum içeren bir tüpü diğer klemense takın. Bu tüpler, hortumun diyalizatta daldırılmış halde kalmasını sağlar. Şimdi, hortumun tamamını diyalizat içeren diyaliz rezervuarına yerleştirin.

Diyalizatı, oda sıcaklığında, manyetik karıştırıcı kullanarak düşük hızda karıştırın. Karıştırma hızının düşük kaldığından ve çözeltinin vortekslenmediğinden emin olun. Diyalizatı bir gün boyunca üç kez değiştirin.

Bu videoda, diyalizat 2,5, 6,5 ve 11,5. saatlerde değiştirilmiştir. Diyalizin toplam 20 ila 28 saat boyunca gece boyunca devam etmesine izin verin. Diyaliz tamamlandığında, tüpleri diyalizattan çıkarın ve örneği almak için kapatmalardan birini dikkatlice açın.

Diyaliz tüpünü üç kez suyla yıkayın ve yıkama sularını numuneye ekleyin. Son olarak, numunedeki suyu burada indirgenmiş basınç altında uzaklaştırın. Bu işlem dondurarak kurutma ile gerçekleştirilir.

Numune dondurulur ve ardından bir dondurarak kurutma cihazına yerleştirilir. Numunedeki serbest metal varlığını değerlendirmek için, öncelikle 1,4 mililitre asetik asidi 400 mililitre suda çözerek asetat tamponu hazırlayın, pH değerini bir molar amonyum hidroksit ile 5,8'e ayarlayın ve toplam hacmi 500 mililitreye tamamlamak için su ekleyin. Daha sonra, her bir kompleksten 0,3 miligramı 0,3 mililitre tampon içerisinde çözün.

Şimdi, pH 5.8 tamponu içerisinde 16 µM konsantrasyonunda olması gereken xol oranj indikatörünü hazırlayın. Daha önce çözünmüş olan metal komplekslerine bu indikatör çözeltisinden üç mililitre ekleyin. İndikatörün sarıdan mora dönen renk değişimini gözlemleyerek serbest metalin varlığını tespit edin.

Arzu edilirse, serbest metal miktarı bir kalibrasyon eğrisi oluşturularak nicelendirilebilir. Eğer serbest metal kalmışsa, karakterizasyon öncesinde numune diyaliz veya yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanılarak daha fazla saflaştırılmalıdır. Ardından, bir opium numunesi için su koordinasyon sayısını belirlemek amacıyla, suda yaklaşık bir milimolar konsantrasyonunda opium içeren kompleks çözeltisi ve aynı konsantrasyonda bir de döteryum oksit çözeltisi hazırlayın.

Analizden önce, kalıntı suyu gidermek için döteryum oksit çözeltisi üç kez buharlaştırılıp döteryum oksit içinde çözülmelidir; spektroflorimetreyi açın, su çözeltisini temiz bir küvete ekleyin ve küveti spektroflorimetrenin içine yerleştirin. Şimdi, sırasıyla yaklaşık 395 nanometre ve 595 nanometre civarındaki maksimum değerleri belirlemek için eksitasyon ve emisyon ölçümlerini gerçekleştirin. Ardından, az önce belirlenen eksitasyon ve emisyon dalga boylarını ve burada gösterilen parametreleri kullanarak bir fosforesans zaman bozunma deneyi gerçekleştirin.

Bu adımı, hazırlanan döteryum oksit çözeltisi ile tekrarlayın; elde edilen lüminesans bozunma verilerinden, yoğunluğun doğal logaritmasının zamana karşı grafiğini çizin. Bu doğruların eğimleri bozunma hızlarını verir. Bu videoda, ham verilerden doğal logaritma grafikleri oluşturmak için Microsoft Excel 2007 kullanılmıştır.

Burada görülen, Hors ve çalışma arkadaşlarının geliştirdiği denklemdeki bozunma hızlarını kullanın. Eğer ligandınız metale koordine olmuş OH veya NH grupları içeriyorsa, denklem kullanılmadan önce modifiye edilmelidir. Numunenin relatif ölçümlerini belirlemek için öncelikle relaksasyon süresi analizöründe T one veya T two seçeneklerinden istenen uygulama modunu seçin.

Burada, T1 ayarı seçilir. Ardından, sulu bir çözücü içerisinde farklı konsantrasyonlarda lantanit içeren kompleks barındıran bir dizi numune hazırlayın. Burada çözücü olarak su kullanılmış olup çözeltiler 10, 5, 2, 0.5, 1.25, 0.625 ve sıfır olarak belirlenmiştir.

Milimolar çözeltiler hazırlanır. Diğer uygun çözücüler veya tamponlar kullanılabilir, ancak kör numune (blank) olarak aynı çözücünün kullanılması önemlidir. Numunenin nihai hacmi, kullanılan cihaza göre değişiklik gösterir.

Bir örneği cihaza yerleştirin ve bu videoda kullanılan ünite için 37 °C olan cihaz sıcaklığına dengelenmesi için beş dakika bekletin. Şimdi, T1 veya T2 için düzgün bir eksponansiyel eğri elde etmek amacıyla yazılım parametrelerini ayarlayarak saniye cinsinden relaksasyon süresini belirleyin. Bu işlemi, boş örnek dahil tüm örnekler için tekrarlayın.

Şimdi, ölçülen T1 veya T2 relaksasyon değerlerinin tersini hesaplayın ve grafikleyin. Bu değerlerin milimolar birimindeki lantan konsantrasyonuna karşı grafiğini çizin ve grafiği düz bir çizgiyle uydurun. Uydurulan doğrunun eğimi, T1 ve T2 için sırasıyla R1 veya R2 olan relaksasyon aktivitesidir.

Burada medyasayon ve saflaştırma için genel şemayı görüyoruz. Bu şema, medyasayon için genel prosedürü ve farklı saflaştırma yollarının seçilme nedenlerini betimlemektedir. Burada, bozunmanın doğal logaritmasının zamana karşı grafiğinin çizildiği temsili bir lüminesans bozunma grafiği görüyoruz; su ve döteryum oksit çözeltileri için gerekli olan benzer eğrilerden elde edilen doğruların eğimleri, opyum içeren komplekslerin su koordinasyon sayısını belirlemek için denklem bir ile birlikte kullanılır.

Livity ölçümlerine dair temsili bir örnek, uydurulmuş çizginin eğiminin örneğin T one livity değerini belirttiği şekilde burada görülebilir. Protokolde açıklanan su koordinasyon sayısı ve livity karakterizasyonuna ek olarak, nihai ürünlerin standart kimyasal teknikler kullanılarak karakterize edilmesi de önemlidir. Bileşiğin kimliği kütle spektrometrisi kullanılarak belirlenebilir; gadolinyum ve opium içeren kompleksler için tanısal izotop modellerini gösteren temsili kütle spektrumları burada sunulmuştur.

Bu prosedürün ardından, elde edilen kompleksleri daha ayrıntılı karakterize etmek için endr spektroskopisi, HPLC ve elementel analiz gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, biyolojik makromoleküllerin işaretlenmesinde kullanılabilecek lantanit içeren komplekslerin nasıl sentezleneceği, saflaştırılacağı ve karakterize edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.