Protein Saflaştırma Kullanım için Otomatik Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi Sütun Seçimi

Bu prosedürün genel amacı, BioRad DUO flow orta basınçlı sıvı kromatografisi sistemi kullanarak rekombinant bir proteinin saflaştırılması için otomatik bir tarama yöntemi aracılığıyla optimal bir HI sıvı kromatografisi kolonu seçmektir. Bu işlem, öncelikle gerekli tamponların ve ilgilenilen rekombinant proteini içeren bakteriyel lizatların hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, duo flow kromatografisi sistemi fiziksel olarak kurulur, borulama işlemleri yapılır ve tarama protokolü için hazırlanır.

Ardından numuneler yüklenir ve fraksiyon numune EIT'sini toplamak için programlanmış HI kolon tarama yöntemi çalıştırılır. Son olarak, EIT analiz edilir ve gözlemlenen ayırma özelliklerine dayanarak optimal HI kolonu ve medyası belirlenir. Nihayetinde, DUO flow otomatik HI kolon tarama yetenekleri kullanılarak, orta basınçlı sıvı kromatografisi yoluyla araştırmacının ilgilendiği proteinin ölçekli saflaştırması için tercih edilen bir HI kolon medyasını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, manuel kolon kromatografisinin ardışık tekrarları gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, işlemin otomatikleştirilmesinin değişkenliği azaltması ve yüksek düzeyde tekrarlanabilir sonuçlar sağlamasıdır. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, modern sıvı kromatografisi sistemlerinin fiziksel karmaşıklığı nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Ancak, bu durum kolaylıkla öğrenilebilir.

Yeterli pratikten sonra, prosedürü laboratuvarımdan iki öğrenci olan Orange Stone ve Shelly Anderson gerçekleştirecek. Başlamak için şu tampon çözeltilerin 500 mililitresini hazırlayın: tampon A1 için 200 milimolar sodyum fosfat, tampon A2 için 200 milimolar sodyum hidrojen fosfat ve tampon B2 için 4,8 molar amonyum sülfat. Deiyonize su, tampon B1 olarak görev yapacaktır; optimal kromatografik çalışma koşullarını sağlamak için tamponların gazını alın. Sistem maksimize edicisi, düşük tuzlu bir fosfat elüsyon tamponu oluşturmak için tampon A1 ve A2'yi, yüksek tuzlu amonyum sülfat oluşturmak için ise tampon B1 ve B2'yi karıştıracaktır.

Başlangıç tamponu. Saflaştırılacak proteini içeren 10 mililitre hücre lizatı ile 10 mililitre tampon B ikisini karıştırarak, yüklenecek 20 mililitrelik numuneyi hazırlayın. Hücre lizatı numune çözeltisinin nihai amonyum sülfat konsantrasyonu yaklaşık 2,4 molar olmalı ve böylece başlangıç tamponuna kabaca eşdeğer hale gelmelidir.

Çözeltideki partikül maddeleri uzaklaştırmak için lizat tampon karışımını, düşük protein bağlama kapasiteli 0,45 mikrometre boyutunda bir şırınga filtresinden süzün. Numuneyi, sisteme yüklemeye hazır olana kadar buz üzerinde tutun. Kromatografi sisteminin fiziksel kurulumu ve tesisatı, bu prosedürün en karmaşık yönlerinden biridir.

Duo akış kromatografi sistemini burada gösterilen diyagrama göre kurun. Tüm protokol boyunca yeterli miktarda tampon çözelti bulunduğundan ve boruların batık kalmaya devam edeceğinden emin olun. Numune yükleme valfini ve dinamik numune döngüsünü burada gösterildiği gibi bağlayın; numune döngüsünü, üçüncü konumdaki numune valfi girişine bağlayın.

1/16 inç dış çaplı peak borusundan aynı boyutta sekiz çift hazırlayın. Ardından bu çiftleri, iki kolon seçim valfinin bir ile sekiz arasındaki konumlarına bağlayın. UV detektör lambalarını açıp tüm detektörlerin kalibre edildiğini onayladıktan sonra, fraksiyon toplayıcının akış ayırıcı valfini ve ayırıcı kontrolcüsünü burada gösterildiği gibi takın.

İkinci konumdaki fraksiyon toplayıcı ayırıcı valf ve ayırıcı kontrolörü, kromatografi iş istasyonundan bağımsız olarak çalıştırılır. Ayırma yüzdesini %10 olarak ayarlayın. İkinci konumdaki fraksiyon toplayıcıdaki standart fraksiyon toplayıcı damlatma başlığını bir mikroplaka damlatma başlığı ile değiştirin.

Örnek döngüsünü durulayın ve kromatografi sistemini yıkayın. Ardından, sistemden dakika başına bir mililitre hızında manuel bir elüsyon tamponu akışı başlatın. Bir mililitrelik yüksek kapasiteli tuzak HI kolonlarını, kolon seçim valflerinin iki ila sekiz numaralı konumlarına bağlayın.

İkinci konum kolon seçim valflerini birbirine bağlayan birleşimi çıkarın. Akış yönünün yukarısındaki kolon bağlantılarını duo akışa takın. Tüm hava dışarı atılana ve büyük bir tampon damlası oluşana kadar elüsyon tamponunu bağlantılardan geçirin.

Ardından, kolon girişine bağlı tıpayı çıkarın ve kolonun üzerine büyük bir damla düşük tuzlu tampon çözelti yerleştirin. Daha sonra kolonu akış yönündeki (upstream) bağlantı parçalarına takın. Çıkışı ise akış sonrası (downstream) kolon bağlantı parçalarına ve seçim valfi tüplerine bağlayın.

Geri basınç limitini 40 PSI olarak ayarlayın. Kolonu, dakikada bir mililitre akış hızında beş kolon hacmi elüsyon tamponu ile yıkayın. Kolonu, dakikada bir mililitre akış hızında 10 kolon hacmi başlangıç tamponu ile yıkayın.

pH UV izleri ve geri basınç stabilize olduğunda, kolon seçim valflerini manuel olarak birinci konuma getirin ve tampon akışını durdurun. Numune yüklemek için, numune giriş tüpünü 20 mililitrelik numunenin içine daldırın. Ardından, numune döngü yükleme yıkama valfini birinci konuma ve numune yükleme valfini temizleme (purge) konumuna getirin.

Örnek döngü yükleme pompasını çalıştırarak, örnek örnek yükleme valfine ulaştıktan hemen sonrasına kadar dakikada bir mililitre akış hızıyla pompa tüpüne çekin. Örnek yükleme valfini temizleme (purge) konumundan yükleme (load) konumuna getirin. Biyolojik yazılımındaki kurulum penceresinden, dinamik örnek döngüsüne 10 mililitre örnek çekilene kadar örnek döngü yükleme pompasını dakikada bir mililitre akış hızıyla yeniden başlatın.

Bu tablodaki yıldızla işaretlenmiş sistem cihazlarını seçin. Ardından, programı denemek için altı adet HIC kolonu seçin. Doğrusal azalan tuz gradyanı ve altı kolonluk ön araştırma yöntemi, başlangıç tamponu akışını dakikada bir mililitre hızla manuel olarak başlatır.

Program metod çalışmasını başlattıktan hemen sonra %90'dan %10'a EIT akış ayırmasını başlatmak için ayırıcı kontrolöründeki başlat düğmesine basın; ardından çevrimdışı 96 kuyucuklu plaka fraksiyon toplayıcısının ekran üzerindeki kontrol panelinden başlat düğmesine basın. Beklenen çalışma parametrelerini onaylamak için gerçek zamanlı ekranı gözlemleyin. Farklı HI ortamlarının ön incelemesi sırasında göreli ayrılmayı ve saflaştırmayı tahmin etmek için GFP'ye özgü 397 nanometre absorbans izini, genel protein 280 nanometre absorbans izi ile karşılaştırın. 96 kuyucuklu plaka fraksiyonlarından 5 ile 50 microliters arasındaki alikotlar yeni bir plakaya aktarılabilir ve ELISA veya Western blot ile spesifik protein içeriği, SDS page veya bir Experian mikroakışkan elektroforez sistemi ile toplam protein içeriği açısından analiz edilebilir. Ön inceleme çalışmalarına ait temsili tuz gradyanı iletkenliği ve kolon basıncı burada gösterilmiştir.

Yüksek tuzlu tampon hatlarından çekilen tampon yüzdesi ile ölçülen tuz konsantrasyonundaki değişim, HI metodolojisi için tipiktir. Tuz konsantrasyonu azaldıkça, kolona bağlı proteinler elüe olur; gözlemlenen iletkenliğe karşılık gelen tuz konsantrasyonu, quad tech ve UV detektörlerini hemen takip eden hatta ölçülür. Tuz gradyenti ile iletkenlik izleri arasındaki sapma, tamponun tampon girişinden sistem boyunca geçip iletkenlik monitörüne ulaşması için gereken süreyi belirtir.

Numune çalışması boyunca sistem basıncı ve pH nispeten sabit kalır. Bu şekil, toplam proteinin hat içi tespitine yönelik ardışık HI kolon ön keşif çalışmalarının kromatogramlarını göstermektedir. NGFP, sırasıyla 280 nanometre ve 397 nanometre dalga boyundaki ışık absorbansının ölçülmesiyle gerçekleştirilir.

Her bir ön tarama çalışması için bağıl GFP bolluğu ve ayrımı yaklaşık olarak belirlenebilir. Bu şekildeki iki hattın karşılaştırılmasıyla, rezene FF ön tarama çalışmasının 10, 12, 14, 16 ve 18 numaralı fraksiyonlarına ait kültür tüpleri; karakteristik GFP emisyon spektrumunu gözlemlemek amacıyla ortam veya floresan oda ışığı ile ultraviyole ışık tüpleri altında hem karşıdan hem de yukarıdan görüntülenmiş olup GFP, 14 numaralı fraksiyonda net bir şekilde saptanmıştır. Her iki UV görüntüsünde, soldaki UV panelindeki yaygın mavi renk, UV lambasından yayılan ışıktır.

Çalışma sonrası elde edilen bu veriler, elüat absorbansının 397 nanometrede ölçülmesiyle yapılan hat içi GFP tespitiyle iyi bir uyum göstermektedir; bu ölçüm aynı zamanda 14. fraksiyonun, elüye edilen GFP'nin ana pikiyle ilişkili olduğunu belirlemektedir. Bu prosedürün ardından, saflaştırılan proteinin saflığı ve fonksiyonel aktivitesiyle ilgili ek soruları yanıtlamak amacıyla western blotting, ELISA, atomik kuvvet mikroskopisi ve biyokimyasal yeniden yapılandırma deneyleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu prosedürü uygularken, yöntemin çeşitli noktalarında çift akış sisteminin manuel olarak kontrol edilmesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Örnekler arasında tampon çözeltinin yeniden doldurulması ve numune yüklenmesi, hava kabarcıklarının kontrol edilmesi ve gerektiğinde deteksiyon lambalarının açılıp kapatılması yer alır. Bu videoyu izledikten sonra, optimal HI kolonları ve medyaları için otomatik ön tarama yapmak amacıyla bir sıvı kromatografi sisteminin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Satır içi ve poster analizle değerlendirme, araştırmacının sonraki ölçek büyütme saflaştırması için uygun bir kolon seçmesine olanak tanır; bu işlem, hedef protein saflığını ve verimini artırmak için diğer kromatografik yöntemlerle de birleştirilebilir.