İnfluenza A Viral ribonükleoprotein Kompleksleri saflaştırılması ve Görselleştirme

Bu prosedür, santrifüjleme yoluyla influenza virüs solüsyonundaki kalıntıların temizlenmesiyle başlar. Ardından, viral membran deterjan ile parçalanır ve serbest kalan vRNP'ler gliserol gradyanı üzerinde ayrıştırılır.

Gradyandan gelen santrifügasyon fraksiyonları toplanır ve her fraksiyondan bir alikot yürütülür. V NP'leri içeren pik fraksiyonları belirlemek için SDS sayfasındaki jeller Coomassie Blue ile boyanır; ardından V NP'leri içeren fraksiyonlar santrifügasyonla konsantre edilir ve saflaştırılmış VRP'ler, iletim elektron mikroskobu ile VRP'lerin görselleştirilmesi için negatif boyama yapılan bir bakır TEM örnek ızgarasına uygulanır. Merhaba, ben British Columbia Üniversitesi Zooloji Bölümü'nde Dr. Nellie Pane'in laboratuvarından WinCo Wu.

Ben Lindsay Weaver, daha önce Pane Laboratuvarı'nda görev yaptım. Bugün size bir viral ribonükleoprotein kompleksleri olan influenza saflaştırma prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda, doku kültürü hücrelerinde influenza A virüsünün nükleer importunu çalışmak için kullanıyoruz.

Haydi başlayalım. Deneye, bir adet 11 mm x 34 mm Beckman polikarbonat santrifüj tüpüne 750 µL MNT tamponu ekleyerek başlayın. Ardından, tüpe 2 mg/mL konsantrasyonundaki influenza A virüsü çözeltisinden 500 µL ekleyin; virüsü MNT tamponu ile karıştırmak için pipetle birkaç kez çekip boşaltın.

Karıştırma işleminden sonra, tüpü bir TLA one 20.2 rotoruna yerleştirin ve bir Beckman Optima max E santrifüjde, 4 °C'de 109.000 ×g hızında 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işlemi tamamlandığında süpernatantı uzaklaştırın, ardından peleti 500 µL parçalama tamponu içinde yeniden süspande edin. Yeniden süspande edilen peleti kuvvetlice vorteksleyin ve ardından bir Eppendorf thermo mixer'da 31 °C'de 20 dakika boyunca çalkalayın.

Çalkalama işlemi tamamlandığında, gliserol gradyan sediment hızı santrifügasyonuna geçin. Gliserol gradyanını hazırlamak için, bir Beckman UltraClear 13 milimetre x 51 milimetre santrifüj tüpüne sırasıyla şunları yerleştirin: 1 mililitre %70 (hacim/hacim) GLYCEROL, 0,75 mililitre %50 gliserol, 0,375 mililitre %40 gliserol ve 1,8 mililitre %33 gliserol. Bu gliserol çözeltileri, saf gliserolün NM tamponu ile karıştırılmasıyla hazırlanır.

Ayrıca, hem gliserol hem de tampon içeren bir dengeleme tüpü hazırlayın. Ardından, parçalanmış viral örneği tekrar vorteksleyin ve gliserol gradyanına yükleyin. Tüpü bir Beckman MLS 50 salınımlı kova rotoruna yerleştirin ve gradyanı dört santigrat derecede, 217.000 ×g'de üç saat 45 dakika boyunca santrifüjleyin.

Santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra, tüpün üst kısmından başlayarak gradyentten manuel olarak 250 µL'lik alikotlar toplayın. Fraksiyonları buz üzerinde veya dört °C'de muhafaza edin. Fraksiyonlar toplandıktan sonra, SDS poliakrilamid jel elektroforezi kullanarak analiz etmeye hazırız.

SDS sayfa analizine başlamak için, her fraksiyondan 20 µL'yi yeni bir tüpe alın. Ardından, beş kat derişimli SDS sayfa örnekleme tamponundan beş µL ekleyin ve örneği 95 °C'de beş dakika boyunca ısıtın. Isıtma işleminden sonra, örnekleri kısa süreliğine santrifüjle çöktürün ve %10'luk poliakrilamid jele yükleyin; kuyucuklardan birine moleküler ağırlık belirteçleri ekleyin. Daha sonra, bromofenol mavi yükleme boyası jelin altına yaklaştığında örneklerin jel üzerinden geçişini durdurun.

Jeli SDS-page cihazından çıkarın ve jeli kumasi blue ile boyayın. Boyama sonuçlarına dayanarak, temel olarak influenza nükleoprotein içeren fraksiyonları belirleyin.

İnfluenza A NP yaklaşık 56 kilodalton boyutundadır ve viral ribonükleoprotein komplekslerinde bulunan temel proteindir. Bu nedenle NP bandı, genellikle vRNP'leri içeren fraksiyonlardaki en güçlü banttır. Bir sonraki bölümde, bu vRNP fraksiyonlarını konsantre edeceğiz.

Ağırlıklı olarak NP içeren gliserol fraksiyonlarını birleştirin ve bunları iki adet Beckman 11 mm x 34 mm polikarbonat santrifüj tüpüne paylaştırın; her tüpü etil pirokarbonat veya DEPC ile işlem görmüş ultra saf su ile doldurun. Ardından, karıştırmak için pipetle birkaç kez yukarı-aşağı çekme işlemi yapın. Tüpleri bir Beckman TLA 120.2 rotoruna yerleştirin ve 4 °C'de, 157.000 ×g hızında dört buçuk saat boyunca santrifüjleyin.

Santrifüj işlemi tamamlandığında, süpernatantı uzaklaştırın ve peleti yeniden süspande edin. Purifiye edilmiş V NPS'yi 50 µL'lik DEPC işlem görmüş su alikotlarına bölün; bir alikotu kenara ayırın ve diğerlerini -80 °C'de saklayın. Artık VRP'lerin negatif boyama işlemine geçmeye hazırız.

Bir mikrolitre saflaştırılmış VRNP'yi, taze hazırlanmış ve iki kez filtrelenmiş 9 µL PBS tamponu ile seyreltin; Parlow Dion ve karbon film ile önceden kaplanmış bir bakır TEM numune ızgarasını 30 saniye boyunca glow discharge işlemine tabi tutun. Taze glow discharge işlemi görmüş numune ızgarasını cımbızla tutarak, 5 µL seyreltilmiş VRNP damlasını numune ızgarasının üzerine uygulayın.

Beklerken damlanın grid üzerine emilmesi için sekiz dakika süre tanıyın. Bir tepsiye küçük bir parfüme kağıdı şeridi yerleştirin, ardından parfüm kağıdının üzerine her biri 10 µL PBS tamponu içeren iki damla ve %1 amonyum melidattan oluşan taze hazırlanmış boyama çözeltisinden 80 µL'lik bir damla damlatın. Şimdi, örnek gridini dikkatlice iki PBS damlasına daldırarak toplam bir dakika boyunca yıkayın.

Ardından, örnek ızgarasının kurumasına izin vermeden, bir parça filtre kağıdı kullanarak örnek çözeltisinin bir kısmını ızgaradan çekin. Örnek ızgarasındaki son tampon damlası çekildikten hemen sonra, ızgarayı boya damlacığının içine tamamen daldırın ve bir dakika bekleyin.

Bir dakika sonra, yeni bir filtre kağıdı parçası kullanarak boyama solüsyonunu örnek gridinden tamamen emdirin. Gözlemden önce örnek gridinin birkaç dakika boyunca havada kurumasını bekleyin. Bir transmisyon elektron mikroskobu altında, negatif boyama uygulanmış V nps'lerin temsili transmisyon elektron mikroskopisi görüntüleri burada yer almaktadır.

Burada görebileceğiniz üzere, V NPS yaklaşık 30 nanometre ile 120 nanometre uzunluğunda, değişken uzunluklu çubuk şeklinde partiküllere benzemektedir. Oligomerik NP, daha sonra çift helikal tekrar yapısında katlanan bir NP molekül zinciri şeklinde organize olmuştur. Bu nedenle, bu çubuk şeklindeki partiküllerin her iki ucunda bazen halkalar görülebilir.

İnfluenza viral ribonükleoprotein komplekslerinin nasıl saflaştırılacağını ve görselleştirileceğini az önce gösterdik. Bu prosedürü uygularken, negatif boyama için üranik asetat kullanıyorsanız, vRNP'leri seyreltirken PBS kullanmamak önemlidir.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.