ReAsH / Flash Etiketleme ve Hücreler Tetracysteine ​​Sensör Proteinlerin Görüntü Analizi

Bu prosedürün genel amacı, tetra sistein ve floresan işaretli protein eksprese eden hücreleri flash veya ash boyalarıyla etiketlemek ve sonuçları kantitatif olarak analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle floresan bir protein ile tetra sistein etiketi içeren hedef proteini taşıyan bir plazmidin ilgili hücre hattına transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, eksprese edilen protein R veya flash ile etiketlenir ve mikroskobik görüntülemeye hazırlanmak için spesifik olmayan şekilde bağlanan boya, BAL ile yıkanarak uzaklaştırılır.

Ardından, ash veya flash ve floresan protein kanallarını kullanarak hücrelerin floresan görüntülerini toplamak için konfokal mikroskop kullanılır. Son olarak, ash veya flash'ın hedef proteine bağlanmasını nicelleştirmek için görüntüler Image J kullanılarak analiz edilir. Nihayetinde, ash floresansı ile floresan protein floresansının korelasyonu yoluyla, hücrelerde ash veya flash'ın hedef proteine bağlanma derecesini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, hedef proteini sadece GFP ile işaretlemek gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, proteinin lokalizasyonuna ek olarak konformasyonel değişim gibi ikinci bir özelliğinin de takip edilebilmesidir. Bu yöntem, protein alt yapısı ve fonksiyonu alanındaki oligomerizasyon olayları, konformasyonel değişiklikler ve TAC'nin bağlanma veya yanma yeteneğini değiştiren LI bağlanma olayları gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemle ilgili ilk fikrimizi, hücrelerde met Huntington'ın küçük submikroskobik polimerlerinin nasıl oluştuğunu değerlendirmek istediğimizde geliştirdik.

Veri analizi adımları teknik olarak karmaşık olduğu için öğrenilmesi zordur, bu nedenle bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır. Deneysel prosedürlerin gösterimi şu şekildedir: Birinci adımdan üçüncü adıma kadar olan kısımları, laboratuvarımızdan araştırma asistanı Yasmin Ranson veri analizini göstererek gerçekleştirecektir. Dördüncü adımı ise laboratuvarımızdan yüksek lisans öğrencisi Sevki GaN yürütecektir. İlgilendiğiniz hücre hattı için standart hücre kültürü yöntemlerini ve transfeksiyon için hazır bir canlı hücre görüntüleme lamını kullanın.

İlgilenilen TC etiketi genini içeren plazmidinizi transfekte etmek için yapışkan hücre kültürü hazırlayın. Seçilen transfeksiyon yöntemine göre, TC etiketlerine spesifik bağlanmanın derecesini değerlendirmenin yanı sıra konfokal mikrograflar toplarken kanallar arasındaki floresan sızıntısını (bleed-through) değerlendirmek için pozitif ve negatif kontrollere sahip olmak önemlidir. Bu nedenle, iki renk için, numunelerin tek renkler için hazırlandığından emin olun; bunlar ya tek başına floresan protein ya da mümkünse floresana bağlı bir Tc-tech proteini vb. olmalıdır.

Ancak floresan bir protein olmaksızın. Transfeksiyondan bir ila iki gün sonra, hücreleri 300 µL önceden ısıtılmış Hank dengeli tuz çözeltisi veya HBSS ile nazikçe durulayın; 10 µM 1,2-etanditiyol (EDT) ve 1 µM ASH içeren taze, önceden ısıtılmış HBSS hazırlayın. Hücrelerden HBSS'yi uzaklaştırdıktan sonra, nazikçe 300 µL ASH ortamı ile değiştirin ve bir doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de tam olarak 30 dakika boyunca inkübe edin.

Deneyimlerimize göre, inkübasyon sürelerinin uzaması arka plan floresansını önemli ölçüde artırmaktadır. Etiketleme solüsyonunu hücrelerden nazikçe aspire edin ve bunu 37 °C'de 15 dakika boyunca 250 µM, two three dimer, cap propanol veya BAL içeren ön ısıtılmış 300 µL HBSS ile değiştirin. Yıkama solüsyonunu nazikçe aspire ederek uzaklaştırın ve yerine ön ısıtılmış 300 µL HBSS ekleyin.

Bu yıkamadan sonra hücreler paraformaldehit ile fikse edilebilir, ancak bunun spesifik olmayan sitoplazmik floresansı artırdığını tespit ettik. Bu nedenle, hücreleri genellikle oda sıcaklığında canlı olarak görüntülemiyoruz. Ayrıca, etiketleme öncesinde hücrelerin fikse edilmesi, boyanın bağlanmasını engeller.

Konfokal mikroskopta hücre görüntülemeye başlamak için, bireysel floroforların görüntülenmesine yönelik parametreleri ayarlayın ve kanallar arasında ihmal edilebilir düzeyde sızıntı (bleed through) olduğundan emin olun. Ardından, numunedeki maksimum floresansın dedektörü doyurmaması için fotomultiplier ayarlarını düzenleyin. En iyi görüntüleme ayarları belirlendikten sonra, numuneler arasında bu ayarlardan hiçbirini değiştirmeyin.

200 hertz tarama hızı kullanın, dört çizgi ortalaması toplayın ve pinhole çapını bir alan birimine ayarlayın. Sinyal-gürültü oranıyla ilgili bir sorun yaşanırsa pinhole çapı genişletilebilir. Ancak, bu durum görüntüleme çözünürlüğünde bir miktar kayba neden olabilir.

Mümkünse konfokal görüntüleri 12 bit veya daha yüksek bir formatta toplayın. Kantitatif veri analizinin kalitesini maksimize etmek için, tüm örnekler için hem floresan protein kanalı hem de BI arsenal boya kanalı için görüntüler toplayın.

Verileri analiz etmek için, aşağıdaki eklentilere sahip Image J yazılımını kullanın. Image J'nin 1.32 C sürümünden daha eski bir sürümü kullanılıyorsa, aşağıdaki seçeneklere tıklayın. Aynı anda birden fazla görüntünün açılmasını sağlamak için, düzenleme (edit) seçenekleri giriş/çıkış (options input slash output) kısmına gidin ve dosyaları açmak/paylaşmak için j dosya seçiciyi kullan (use j file chooser to open slash share) kutucuğunu işaretleyin.

Tamam'a tıklayın. İlgili görüntüleri açın. Farklı görüntülerin farklı piksel yoğunluklarına sahip olması nedeniyle, Image J her bir görüntü için ekranda görüntülenen maksimum ve minimum piksel yoğunluklarını otomatik olarak ayrı ayrı tanımlayacaktır.

Bu, görüntülenen resimlerin mevcut halleriyle karşılaştırılamayacağı anlamına gelir. Açılan resimlerin tamamının aynı ölçekte olduğundan emin olmak için, görüntülenecek üst ve alt piksel yoğunluklarını fiziksel olarak tanımlayın. Bu değerleri ayarlamak için resim seçeneğini belirleyin, parlaklık/kontrast ayarını yapın.

Set (ayarla) seçeneğine tıklayarak görüntülenecek minimum ve maksimum değerleri tanımlayın. Ardından, propagate to all open images (tüm açık görüntülere yay) seçeneğini belirleyip tamam'a tıklayın. Alternatif olarak, belirli bir kanal için tüm görüntüleri tek bir dosyada veya yığında (stack) toplayın.

Ardından Image J, tüm görüntüleri otomatik olarak aynı ölçeğe ayarlayacaktır. Bunun için, istiflenecek görüntüleri seçin, her dosya için ortak bir isim girin ve etiketler olarak başlıkları kullan seçeneğini belirleyin. Tamam'a tıklayın.

Analiz için açık olan tüm görüntüleri sekiz bite dönüştürün. Görüntü tipi olarak sekiz bit seçildiğinde, görüntülenen aralık sıfır ile 255 arasına yeniden ölçeklendirilecektir. Bilgi kaybına neden olacağı için orijinal 12 bit veya daha yüksek formatın üzerine kaydetmemek önemlidir.

Farklı Kaydet seçeneğini kullanarak sekiz bit dönüştürülmüş adlı yeni bir klasöre bir kopya kaydedin. Tüm bir görüntüde bi arsal boya bağlanmasının derecesini incelemenin bir yolu, piksel yoğunluğu korelasyon grafiği oluşturmaktır. Bu grafik, bir kanaldaki her bir piksel değerini ikinci kanaldaki karşılık gelen piksel değerine göre belirler.

Bu nedenle, yüksek bağlanma olduğunda, GFP floresansı yüksek olan bir piksel konumu ash floresansında da yüksek olacaktır. Piksel ko-korelasyonunu analiz etmek için, sekiz bitlik REA ve GFP görüntülerinin ImageJ'de açık olduğundan emin olun. Ardından, Plugins > Image Correlator seçeneğini belirleyerek görüntü korelatörü eklentisini açın. Görüntü dosyalarını görüntü bir ve görüntü iki olarak atayın.

Ardından tamam'a tıklayın. Oluşan yığındaki detaylı bilgiler görüntülenmeyebilir. Bu durum normaldir.

Yığını scatterplots adlı yeni bir klasöre kaydedin ve örneğe referans veren örnekle aynı dosya adını verin. Örneğin, Ash GFP Correlation plot. Verileri görüntülemek için iki seçenekten birini seçin.

İlk olarak, "process math log auto" seçeneğini belirleyerek veriyi log formatına dönüştürün. Ardından veriyi görsel olarak yeniden ölçeklendirmek için "image adjust brightness slash contrast" kısmına tıklayın ve "auto" seçeneğini seçin. İkinci olarak, yalnızca düşük değerleri göstermek için veriyi görsel olarak yeniden ölçeklendirin ve özel bir LUT oluşturmak için verileri özel bir bakma tablosu veya LUT kullanarak görüntüleyin.

Çok basit bir LUT için görüntü renk düzenleme LUT'una tıklayın. Sol üstteki piksele tıklayın ve siyah rengi seçin. Ardından sağdaki bir sonraki pikseli seçin ve kırmızı rengi seçin.

Ardından, üçüncü piksele tıklayın ve fare düğmesini basılı tutarak seçimi sağ alt piksele doğru sürükleyin. Kırmızı rengi seçip tamam'a tıklayın, ardından beyaz rengi seçip tamam'a tıklayın. Görüntüyü ekranda gösterilenle sabitlemek için, daha önce açıklandığı gibi parlaklık/kontrast aralığını 0 ile 255 arasında seçin.

Görüntüleri diğer programlara kopyalayıp yapıştırmak için RGB formatına dönüştürün. İlk olarak, daha önce açıklandığı gibi sekiz bitlik veya 16 bitlik görüntüleri açın. GFP için görüntülere bir LUT renk şeması atayın.

Görüntü üzerine tıklayarak yeşil LUT'u atayın. Bakma tabloları yeşil. Son olarak, kopyalanacak görüntüyü seçin ve panoya kopyalayın. Düzenle kopyala sistem seçeneğini belirleyerek, bu şekil; kinase sock füzyonlanmış, GFP ve 30 dakika boyunca boyanmış bir TC etiketi için tipik bir sonucu göstermektedir.

HEC 2 9 3 hücrelerinde ash ile yapılan çalışmada, ASH'nin TC etiketi taşıyan hedef proteine yüksek afinite ile verimli bir şekilde bağlandığı görülmektedir. Buna karşılık bu şekil, hem TC etiketinin özgüllüğünü hem de arka plan boyama düzeyini doğrulamak için gerekli olan, GFP ile birleştirilmiş ancak TC etiketi taşımayan SARK'ın ilgili kontrol örneğini göstermektedir. Bu sonuç, RH'nin TC etiketi taşımayan hedef protein ile herhangi bir reaktivite göstermediğini ortaya koymakta ve bu da TC etiketinin SSH bağlanması için özgüllüğünü göstermektedir.

Bu prosedürü uygularken, hücrelerin konfluansa ulaşmasına ve durgunlaşmasına izin vermemeniz gerektiğini unutmamak önemlidir, çünkü bu durum hücrelerdeki V bağlanmasını etkileyecektir. Bu videoyu izledikten sonra, verilerinizi nicel olarak nasıl basitçe analiz edebileceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalı ve veri görselleştirme için kendi özgün IUTS yöntemlerinizi geliştirmek adına bu metodları optimize edebilmelisiniz.