CD4 + T-Lenfosit Yakalama HIV için Disposable mikroakışkan Chip

Merhaba, benim adım Richard Lin; Harvard MIT Sağlık Bilimleri ve Teknolojileri Bölümü'nde Profesör TI Mercy'nin grubunda araştırmacıyım. Üzerinde çalıştığım proje, kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda kullanılmak üzere, hasta kanındaki CD4 pozitif ve C3 pozitif T lenfositlerinin miktarını belirlemek ve bunları yakalamaktır.

Şu an önümde, PDMS'den (Polidimetilsiloksan) yapılmış bir mikroakışkan cihaz bulunuyor. Cihazın kanal yüksekliği 50 µm olup cihazdaki toplam hacim 10 µL'dir. Bu, T yardımcı lenfositlerini yakalamak için kullanacağımız son derece hassas bir cihazdır.

Temel olarak, HIV hastaları için tanısal referans noktasıdır. Mikro akışkan cihazın yüzeyi proteinle hazırlanmış ve şırıngada CD4 pozitif antikorlar bulunmaktadır. Şu an elimizde pH 7.4'te PBS biyolojik tamponu var ve fazla CD4 pozitif antikoru temizlemek için bunu kanala akıtacağız.

Bu aşamada, sadece fazla maddeleri temizlemeye çalıştığımız ve akış hızının pek bir önem taşımadığı için hızı kontrol etmeye gerek yoktur. Cihazın girişleri burada olacaktır ve çıkışlar ise benim solumda, sizin sağınızda yer alacaktır. Şimdi fazla antikor çözeltisini temizleyeceğim; çıkıştan sıvı geldiğini fark edebiliyorsanız, bunun çok küçük bir miktar olduğunu ancak yakından baktığınızda tüpler aracılığıyla kanaldan sıvı çıktığını görebileceğinizi belirtmek isterim.

Fazla antikor çözeltisini temizlediğimize göre, artık kan enjeksiyonu aşamasına geçebiliriz. Bu nedenle, tüpleri giriş kısmından çıkaracağım. Şimdi, insan tam kanı içeren yeni bir şırınga açacağız.

Bu bir hasta örneği değil, mikroakışkan cihaza kanı enjekte etmeye hazırlanırken kullandığımız sağlıklı bir deneğe ait sağlıklı bir örnektir. Şimdi şırıngayı şırınga pompasına takacağız. Ardından cihazı açacağız ve şırınganın akış hızlarını görebileceksiniz; bunu dakikada 5 µL olacak şekilde ayarladık.

Şimdi temel olarak kan enjeksiyonu için hazırlık yapacağız. Şırınga pompasını dikey olarak yerleştireceğiz çünkü bildiğimiz üzere kan hücreleri çökelme yapar ve biz hücrelerin kanala akmasını isteyeceğiz. Bu nedenle hücrelerin, tüpümüzün hemen yanında bulunan tabana çökelmesini tercih ederiz.

Böylece artık her şey hazır hale geldi. Cihazımın hacmi 10 µL başına 10 µL'dir. Kanal duvarına akıtmak istediğimiz hacim de yine 10 µL'dir.

Kanalın rengine bakarak yeterince kan akıtıp akıtmadığımı anlayabiliyorum; eğer kanal tamamen kırmızıyla dolmuşsa, 10 µL akıttığımı anlarım ve şırınga tamponunu durdurmam gerekir. Şimdi başlatma düğmesine basacağım ve işlem başlayacak; bazen kanın kanala gerçekten girmesi biraz zaman alabiliyor. Bu durum büyük oranda basınca bağlıdır.

Örneğin, şırıngayı yerleştirdiğimizde, tüpteki kanı ayarlamak için bazen sıvıyı geri çekebilir veya enjekte edebiliriz. Bu nedenle işlem biraz zaman alabilir ancak kan bir kanala pompalanmaya başladığında, akış hızı istediğimiz değer olan ly/dakika seviyesine ayarlanmış olur. Bu noktada biraz sabırlı olmamız ve beklememiz gerekebilir; kanın kanala ulaşmaya başlaması bazen iki üç dakika sürebilir.

Şu an kanın kanala girmeye başladığını görebilirsiniz. Dolayısıyla cihazın neredeyse tamamen dolduğunu söyleyebiliriz. Tamam, şimdi kanaldaki kanı temizlemek için boru hattını tekrar PBS'ye çevireceğiz.

Bunu yapmak için, boruları çıkarmak için daha önce yaptığımız işlemleri tekrarlayacağız. PBS akış hızını kontrol etmeye hâlâ ihtiyaç duyduğumuz için şırınga pompasına hâlâ ihtiyacımız var. Ancak, artık kan akışı sağlamadığımız ve PBS içinde hücre bulunmadığı için, şırınga pompasını dikey konumda tutmamıza gerek yoktur.

Şimdi her şey hazır ve cihazdaki kanı dışarı atacağız; bunun için buradaki keskin butonuna tekrar basacağım. Gördüğünüz gibi, cihaz temizlenmeye başlıyor. Kenarlarda hâlâ biraz kan var ancak yavaş yavaş yok oluyor.

Tüm kan tükendiğinde, akış hızını dakikada 5 µL'den dakikada 20 µL'ye çıkaracağız. Bu değişikliğin nedeni, kanda aslında C4 pozitif antijenlere sahip iki hücre tipi bulunmasıdır. Bunlardan biri, aradığımız hücreler olan T yardımcı lenfositlerdir.

Diğerleri ise monositler olarak adlandırdıklarımızdır. Cihazımızın, hem T yardımcı lenfositleri hem de monositleri yakalamak yerine, özellikle sadece T yardımcı lenfositlerini yakaladığından emin olmak istiyoruz. Bunu gerçekleştirmek için kullandığımız yöntem, akış hızını artırmaktır; çünkü monositlerin T yardımcı hücrelerinden daha büyük boyutta olduklarını biliyoruz.

Böylece akış hızlarını artırarak, daha büyük olan monositlerin yüzeyden ayrılmak için CD4 pozitif T yardımcı hücrelerine göre daha fazla basınca maruz kalmaları sağlanacaktır. Şu an yaklaşık 20 dakikadır işlem sürmektedir. Şu an elimde bulunan bir çözeltidir.

Buna faks lizleme çözeltisi denir. Bunun buradaki amacı kırmızı kan hücrelerini lizlemektedir. Kanalda kırmızı kan hücrelerinin kaldığı her yerde, bu çözelti onları lize edecektir.

Bu, stok çözeltiden 10 kat seyreltilmiştir. Şimdi yapacağımız işlem, şırınga pompasını durdurmak, hortumu çıkarmak ve temel olarak çözeltiyi bu şırıngadaki ile değiştirmektir. Şimdi makineyi durduruyorum, hortumu çıkarıyorum, bunu ayırıyorum, bu şırıngayı alıyorum ve yenisiyle değiştiriyorum.

Tamam, her şeyi kurduğuma göre, hızı tekrar dakika başına beş mikrolitreye düşüreceğiz. Hız kısmında 20 olan değeri tıklayıp beş olarak düşüreceğiz ve şimdi fax license çözeltisini 20 dakika boyunca akıtacağız. Ve şimdi başlat düğmesine basacağız.

Şu anda önümüzde, cihazın 10x büyütme ile çekilmiş bir optik görüntüsü var. Buradaki tüm bu beyaz noktaları görebilirsiniz. Peki, bu hücrelerin aradıklarımız olduğundan nasıl emin olabiliriz?

Bu nedenle, ilk kullandığımız boyanın DPI olduğunu belirtmek için birkaç farklı boyama yöntemi kullanıyoruz; DPI çekirdeği boyar. Temel olarak, beyaz kan hücreleri gibi çekirdeği olan tüm hücreler boyanırken, çekirdeği olmayan kırmızı kan hücrelerinin boyanmadığını söyleyebiliriz ve bunun görüntünün genelinde olduğunu görebilirsiniz. Tüm bu mavi noktalar vardır ve her biri mavidir.

bir hücredir. Bu nedenle bir sonraki adım, hücrelerin C4 pozitif antijen dediğimiz yapıya sahip olup olmadığını kontrol etmektir. Bu son derece önemlidir çünkü cihazımızın tüm amacı C4 pozitif hücreleri yakalamaktır.

Sıradaki, kullandığımız floresan antikor elbette C4'e özgüdür. Bir sonraki slayta geçelim. Bu resimde hücrelerin çok daha sönük çıkmasının nedeni, kullandığımız floresan antikorun genellikle dört faktörlü olmasıdır.

Böylece dilüsyon çok daha yüksektir. Ancak yakından bakarsanız, bu görüş alanına yayılmış noktaların hâlâ olduğunu görebilirsiniz. Bunlar oldukça sönüktür.

Ancak daha yakından incelediğimizde, bu hücrelerin CD4 pozitif olduğunu söyleyebiliriz; bu iyi bir durum çünkü tam olarak istediğimiz şey buydu. Bir sonraki aşama ise, daha önce belirttiğim gibi, iki farklı tipte CD4 pozitif hücre olmasıdır. Bunlardan biri, istediğimiz hücreler olan T yardımcı hücreler, diğeri ise monosit olarak adlandırdıklarımızdır.

Bu nedenle, iki hücreyi birbirinden ayırt etmek için tekrar başka bir floresan antikore ihtiyaç duyuyoruz. T yardımcı lenfositlerin üzerinde CD3 pozitif antijenler olduğunu, monositlerde ise bunların bulunmadığını biliyoruz.

Sırada kullandığımız antikor CD3 spesifik olanıdır ve bunu bu resimde görebiliriz. Yine, noktaların cihazın etrafına dağıldığını görebilirsiniz; bazı hücreler bazen daha parlak göründüğü, bazıları ise görünmediği için noktalar daha büyük görünmektedir. Yani, bu durumda pek çok şey şansa bağlıdır ancak çoğu durumda, bu parlak kırmızı noktaların tamamı hücrelerdir.

Yani burada tekrar, hücrelerimizin CD4 pozitif ve CD3 pozitif olduğundan emin olmak istiyoruz. Bu durumda, hücrelerimizin çoğunun CD3 pozitif olduğunu görebilirsiniz ki bu iyi bir durumdur. Bu bize yakalamamızda özgünlük sağlar.

Büyük noktalar atık olabilir, ancak çoğu zaman gerçekleşen durum şudur; bazen bir hücre tesadüfen kendi üzerine daha fazla CD3 kümesi, yani CD3 toplamış olabilir. Bu resimde, bu mikroakışkan cihaz için topladığımız verilerden biri görülmektedir ve bu temel olarak bir hücre yakalama düzeneğidir. Önceki slaytlarda, üzerinde hücrelerin olduğu birçok resim olduğunu fark etmişsinizdir.

Peki, bunlar gerçekte neye dönüşüyor? Aslında bunlar bir hücre yakalama profiline dönüşüyor; bu durumda X eksenine girişten olan uzaklığı, Y eksenine ise yakalanan hücre diskini yerleştirebiliriz. Cihaz boyunca, yoğunluğunuzun başlangıçta son derece yüksek olduğunu ve ardından yavaşça azaldığını görebilirsiniz; kan dolaşımından C4 pozitif ve C3 pozitif hücreleri yakaladığımız için kan örneğindeki bu hücrelerin konsantrasyonunun azalmasını bekleriz, bu da beklediğimiz sonuçtur.

Verilerimiz genellikle temel olarak bu şekilde sunulmaktadır.