İmmünohistokimya: Parafin Bölüm Vektör Labs Vectastain ABC Seti

Merhaba, ben Victor Chi; California Üniversitesi Irvine, Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü'ndeki Chandy Laboratuvarı'nda lisansüstü öğrencisiyim. Bugün, Vector Laboratories'in A b, C kiti kullanılarak parafin gömülü kesitlerin nasıl boyanacağını göstereceğim. Bu prosedür; parafin gömülü kesitlerin dewaksajını ve hidratasyonunu, antijenleri açığa çıkarmak için ısı ile uyarılmış antijen geri kazanımının gerçekleştirilmesini, peroksidazın ve spesifik olmayan protein bağlanmasının bloke edilmesini, CD four, tirozin hidroksilaz ve sekonder antikorlarla inkübasyonu, ardından lamın geliştirilmesini ve kapatılmasını içermektedir.

Öyleyse başlayalım. Lamlar parafine gömüldüğü için ilk adım lamlardaki parafini uzaklaştırmaktır. Bu işlem genellikle bir çeker ocak içerisinde, her biri beşer dakikalık üç yıkama şeklinde, üç ksilen kavanozu kullanılarak gerçekleştirilir.

Ardından lamlar %100 etanol içine konur. Lamlar üzerindeki mumun gittiğini fark edeceksiniz, ancak lamları eldivenle tutmamaya dikkat edin çünkü ksilen eldivenlerin kauçuğunu çözer. Buradan itibaren, lamları %100 etanol içinde, bir hidratasyon gradyanına tabi tutulacakları laboratuvara geri taşırsınız.

Burada, lamlarımızı uygulayacağımız hidratasyon gradyanından bahsedeceğim. İşlem önce %100 etanol içeren iki banyo ile başlar. Ardından, lamlarımızı %95 etanol içeren iki banyoya aktarırız.

Ardından lamlarımızı %70 etanol banyosuna, oradan da %50 etanol banyosuna aktarıyoruz. Sonrasında lamlarımızı %30 etanola aktarıyor ve iki dakika sonra çift distile suya aktarıyoruz. Çift distile su işlemi sonrası, lamlarımızı PBS içerisinde bekletiyoruz.

Şimdi size, slaytların taşıyıcılar yardımıyla bir banyodan diğerine nasıl aktarılacağını göstereceğim. İlk adım olarak, taşıyıcı tutucunuzu kullanarak slaytları çıkarın ve bir sonraki banyoya çok fazla sıvı taşımamak için fazla sıvıyı nazikçe sıyırın. Ardından, slaytı banyoya daldırın ve bir sonraki gradyan değişimine kadar iki dakika bekleyin.

Dokular fikse edildiğinde, çoğu zaman antijen maskelenir ve böylece antikor ona bağlanamaz. Bu nedenle şimdi size sodyum sitrat kullanarak ısı ile indüklenen antijen geri kazanımı yöntemini göstereceğim. Şu an, immünohistokimya ile tespit etmeye çalışacağım CD eight antijenini maskesiz hale getireceğim mikrodalga fırının yanındayız.

Şimdi çözeltimi ekleyip 15 dakika boyunca mikrodalgada ısıtacağım. Slaytlarımızın kurumasını önlemek için sodyum sitrat ile birlikte 15 dakika kaynatacağız. Sıvı taştığında, slaytların nemli kalmasını sağlamak için sodyum sitrat ile tekrar doldurmak üzere slaytlarımızı takip edeceğiz.

Slaytlarımı sodyum sitrat içine yerleştirmeden önce, çözeltimi 45 saniye boyunca önceden ısıttım. Ardından slaytlarımı sodyum sitrata yerleştirdim ve şimdi sodyum sitratı 15 dakika boyunca ısıtıyorum. Slaytlar içindeyken, çözelti genellikle kaynama işleminin ikinci veya ikinci buçuk dakikası civarında taşmaya başlar.

Bu noktada işlemi durduracağım ve eksilen sodyum sitratı taze sodyum sitrat ile tamamlayacağım. Sodyum sitratı 15 dakika kaynattıktan sonra, lamlarımızı ve çözeltiyi çıkarıp soğutmak istiyoruz. Bunu yapmanın en iyi yolu, lam tutucunun kapağını kapatmak, fazla sıvıyı boşaltmak ve kavanozun içindeki çözelti oda sıcaklığına gelene kadar soğuk su akışının altında tutmaktır.

Bu işlem genellikle yaklaşık 10 ila 15 dakika sürer. Lamları lavabodan çıkardıktan sonra, dokulardaki endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmemiz gerekir. Bunun için %30'luk hidrojen peroksit kullanarak %1'lik bir hidrojen peroksit çözeltisi hazırlayacağız.

Buradan itibaren, lamları doğrudan hidrojen peroksit çözeltisine aktarıyorum. Şimdi lamlarımızı 20 dakika boyunca hidrojen peroksit içinde inkübe edeceğiz. 20 dakika geçtikten ve endojen peroksidaz bloke edildikten sonra, lamlardaki hidrojen peroksiti PBS yıkamalarıyla temizleyeceğim.

Şimdi lamlarımı taşıyıcıya aktaracağım ve her biri beş dakika süren üç yıkama işlemi uygulayacağım. Dokulara zarar verebilecek diğer lamlarla teması önlemek için bu lamlar sırt sırta yerleştirilmiştir. Bu nedenle lamları sadece kaydırarak çıkarıyorum ve dokunun cama temas etme olasılığını ortadan kaldıracak şekilde düzenliyorum.

Burada slaytlarımızı PBS'ye aktarıyoruz. Slaytlarımızı PBS ile yıkadıktan sonra, şimdi %5 BSA, %5 keçi serumu ve %0,1 sodyum azid içeren bir solüsyonla proteinlerin spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için slaytları bloke edeceğim. Eğer keçi antikorlarıyla çalışıyorsanız, keçi serumunu başka bir türe ait serumla değiştirmeniz gerekir.

Şimdi, lamları lam tutucuya yerleştireceğim ve çözeltimizi ekleyeceğim. Normalde, lamların hacmiyle birlikte dokuların tamamen battığından emin olmak için kabı yarıya kadar doldururum. Lamları kaba yerleştirirken dikkat etmeniz gereken noktalardan biri, dokuların kabın kenarlarına temas etmesini önlemektir.

Son lam için, doku kabın kenarına değmeyecek şekilde içeri doğru döndürün. Lamları gece boyunca blokladığım için, şimdi fazla bloklama solüsyonunu her biri beş dakika süren üç kez PBS ile yıkayarak temizleyeceğim. Bu aşamada, kullanılan antikor miktarını minimize etmek için dokumuzun etrafına sıvı bloklayıcı ile bir daire çizmek istiyoruz.

Antikor tasarrufu konusunda endişeniz yoksa, slaytları her zaman bloklama adımını gerçekleştirdiğimiz aynı kaplarda inkübe edebilirsiniz. Bu noktadan itibaren, dokumuzun etrafını sıvı bloklayıcı ile nasıl çevrelediğimizi göstereceğim. Öncelikle, dokuya temas etmemeye dikkat ederek fazla sıvıyı uzaklaştırıyoruz.

Fazla sıvıyı temizlemek için köşelerin etrafını silin. Tekrar belirtmek gerekirse, dokuya dokunmamaya çok ama çok dikkat edin. Sıvı bloklama pimini alın, hafifçe bastırarak akışı başlatın ve buradan itibaren kaleminizle dokunun etrafını çevreleyin.

Sıvı bloklayıcının yaklaşık 15 saniye boyunca kurumasına izin verin. Bu aşamada, primer antikoru eklemek istiyoruz. Bu nedenle, bir pipet kullanarak dokuyu primer antikorla tamamen kapladığınızdan emin olun ve ardından dokuyu nem kontrollü kutunuza aktarın.

Bu nedenle, bir Kim wipe kullanıyoruz. Lamın primer antikor ile inkübe olduğu süre boyunca kurumasını önlemek için, bu kutudaki biraz di water ile nemlendirdik. Primer antikorumuz bir saat boyunca inkübe edildiğine göre, şimdi lamlarımızı çıkaracağız ve fazla antikoru PBS ile yıkayarak temizleyeceğiz.

Bu nedenle, sıvının süzülmesini bekleyin ve örneği PBS yıkama çözeltisine yerleştirin. Ardından, beşer dakikalık üç yıkama daha gerçekleştirin. Üç adet beş dakikalık yıkama işleminden sonra, primer antikoru eklediğimiz yöntemle ikincil antikorumuzu dokuya ekleyeceğiz.

Dokularınızı kaplayacak kadar hacim kullanarak, burada kullandığımız keçi anti-tavşan olan sekonder antikoru ekleyin ve lamınızı nem kontrollü hazneye geri yerleştirin. ABC yöntemini kullandığınızda temel öneme sahip olan biotinile keçi anti-tavşan sekonder antikoru kullanıyoruz. Böylece lamımızı nem kontrollü hazneye aktarıyoruz ve bir saat boyunca inkübasyona bırakıyoruz.

Sekonder antikor inkübe olurken ABC reaktifini hazırlamamız gerekiyor. Vector Laboratories'in Vector Stain kitindeki ABC reaktifini kullanıyoruz. A reaktifini çıkarın, uç kısmını hazırlayın ve tüpü sıkmamaya dikkat ederek 15 mL PBS içine üç damla damlatın; çünkü damlaların özellikle ölçülü ve belirli bir boyutta olması gerekir.

Sekonder antikor inkübasyonu yaklaşık bir saat sürdükten sonra, lamlarınızı alın ve tıpkı primer antikorla yaptığınız gibi tekrar PBS ile yıkayın. Her biri beş dakika süren üç yıkama işleminden sonra, lamlarınızı 30 ila 45 dakika önceden hazırladığınız ABC reaktifini eklediğiniz bu kaba aktarın. Ardından ABC reaktifini buraya ekleyip lamların üzerini doldurun ve 30 ila 45 dakika daha inkübe olmaya bırakın.

Slaytlarınız yaklaşık 3-5 dakika boyunca ABC içinde bekledikten sonra, fazla ABC solüsyonunu yıkamak isteriz. Bu nedenle slaytlarınızı çıkarıp PBS solüsyonuna ekleyin. Aynı yıkama işlemini, her yıkama için beşer dakika olacak şekilde PBS içinde üç kez tekrarlamak isteriz.

Slaytlar yıkanırken, Vector Laboratories marka DAB peroksidaz substratını hazırlıyorum. pH 7.5 tampon çözeltisinden iki damla ekliyorum. pH 7.5 tampon çözeltisinin ardından, DAB substrat reaksiyon reaktifinden iki damla ekliyorum.

Yine belirtmek gerekir ki, damla boyutu kritiktir, bu nedenle şişeyi sıkmayın ve damlaların kendiliğinden düşmesine izin verin. pH 7.5 tamponu için iki damla ekleyin. Ardından, yine damlamasına izin vererek dört damla DAB substrat reaktifi ekleyin.

Son olarak, iki damla hidrojen peroksit substrat reaktifi eklemek istersiniz. DAB substrat reaktif karışımı bu şekilde görünmelidir. Artık lamlara eklemeye hazırdır; lamlarınızı çıkarın ve PBS'nin lamlarınızdan süzülmesini sağlayın.

Zamanla DAB reaktifi daha kahverengi bir renk alır. Bu aşamada reaktifi lamlara eklemek isteriz. Dokuları kaplayacak kadar hacim alarak doğrudan doku örneklerinin üzerine ekleyin.

Uygun hacmi alıp doğrudan doku örneklerinizin üzerine ekleyin ve doku örnekleriniz zamanla daha kahverengiye döneceği için solüsyonun gelişmesine izin verin. DAB solüsyonunu ekledikten sonra, bu beyin kesitinde dokunun burada ve şurada kahverengiye döndüğünü görebilirsiniz. Kahverengi DAB boyaması, orta beyin dopaminerjik nöronlarını içeren bölgeyi ortaya çıkarmaktadır.

Lamlarınızı iki ile 10 dakika arasında geliştirdikten sonra, reaksiyonu durdurmak için lamları buz gibi soğuk suya eklemeniz gerekir. Bu nedenle, çözeltinin süzülmesine izin verin ve lamlarınızı doğrudan buz gibi soğuk suya ekleyin. Lamlarınızı buz gibi soğuk suya daldırdıktan sonra, banyonuzu lavaboya götürün ve tüm DAB çözeltisinin banyodan tamamen süzüldüğünden emin olmak için içine yaklaşık beş dakika boyunca soğuk su akıtın.

Bu nedenle, lavaboya ekleme yaparken akıntının dokuya çarpmamasına dikkat edin; bunun yerine akıntının köşelerden birine çarpmasını ve dokularınızın suyun akışıyla sarsılmaması için sadece taşmasını sağlayın. Slaytları yıkamadan çıkardıktan sonra karşıt boyama yapmanız gerekir. Peki, neden karşıt boyama yapmak isteyesiniz?

Bunun bir nedeni, dokunuzun yapısını görmek istemeniz olabilir. Bir diğer nedeni ise tüm hücreleri görselleştirmektir. Bu nedenle, çekirdekleri temsil eden hematoksilen ile karşıt boyama yapacağız.

Şimdi lamlarımızı alıp fazla sıvıyı uzaklaştıracağız ve lamları Hemat Hematin çözeltisine sadece bir kez daldıracağız. Bir kez daldırıp çıkardıktan sonra doğrudan suyun içine ekleyin. Lamları musluk suyuna ekledikten sonra, daha önce buz gibi soğuk su banyosuyla yaptığınız gibi lamları suyun altında tutun.

Hematoksilen yıkama işlemi için, kavanozun içindeki su berraklaşana kadar musluk suyu altında bekletin. Kontrast boyanan lamları sudan çıkardıktan sonra, lamları yenidenyansızlaştırmak (dehidre etmek) isteriz. Bu nedenle lamları, etanol gradyanından ters sırayla tekrar geçirmemiz gerekir.

Süreç şu şekilde ilerleyecektir: bir kez deiyonize su ile, bir kez %30 etanol ile, bir kez %50 etanol ile, bir kez %70 etanol ile, iki kez %95 etanol ile ve iki kez %100 etanol ile yıkama yapılacak ve her bir yıkama iki dakika sürecektir. Lamlarınızı çıkarın, fazla sıvıyı silin ve doğrudan %30 etanola ekleyip iki dakika bekletin. Son %100 etanol yıkamasından sonra lamları tekrar ksilen içerisine yerleştirmeliyiz.

Slaytlarınızı tekrar alın, fazla sıvıyı sıyırın, slaytları alın ve beş dakika boyunca ilk ksilen çözeltisine ekleyin. Böylece, her biri beş dakika süren üç ardışık ksilen yıkaması yapılmış olacak. Artık slaytlarımızı monte etmeye hazırız.

Genellikle yaptığım işlem, slaytlar hazır olmadan bir dakika önce pastör pipetimle perm mount solüsyonunu çekmek ve slaytlar çıkmaya hazır hale gelene kadar yaklaşık bir dakika beklemetir. Son ksilen yıkamasından sonra, eldivenlerinizi ksilenin içine daldırmamaya veya ıslatmamaya dikkat ederek, dokunun hangi tarafta olduğuna özen gösterip slaytları bir cımbız yardımıyla çıkarın. Dokuya dokunmamaya dikkat ederek, fazla ksileni bir Kimwipe ile nazikçe silin; sadece köşeleri ve kenarları dikkatlice silerek ksilenin büyük kısmının buharlaşmasını sağlayın. Muhtemelen biri kurumadan önce iki slayt üzerinde çalışabilirsiniz.

Bir lamın kuruması tamamlandığında, diğer lam çalışmaya hazır olmalıdır. Tamamen kurumadan önce bunlar üzerinde çalışmanız gerekir. Bu nedenle, perimount'u alıp dokunuza değdirmemeye dikkat ederek dokunuzun yanına ince bir çizgi çekmelisiniz.

Kapak camınızı alarak perimount'u temizleyin. Kapak camını 45 derecelik bir açıyla yerleştirin ve yavaşça aşağı doğru eğilmesini sağlayın. Ardından, perimount'un tüm dokuları kapladığından emin olarak kapak camını kaydırın.

Ardından, onu yerleştirin ve tüm fazla hava kabarcıklarını gidermek için merkezden hafifçe bastırın. İkinci dokunuzla çalışırken kurumaya bırakın; ancak lamlara hemen bakılmamalıdır. Lamlarımızı incelemeden önce perma mount'un gece boyunca kurumasına izin vermemiz gerekir.

Aksi takdirde, mikroskop ışığı altında perma mount kabarcıklar oluşturacak ve böylece numuneniz bozulacaktır. İşte kimyasallar ve tirozin hidroksilazı hedefleyen tavşan poliklonal antikoru ile boyama sonrası beyin kesitlerimizin görünümü. Yine, kahverengi DAB boyaması orta beyindeki dopaminerjik nöronların konumunu göstermektedir.

Hematin karşıt boyası, bu dokudaki tüm çekirdekleri maviye boyar. Böylece, Vector Laboratories'den alınan ABC kitini kullanarak parafin gömülü kesitlerin nasıl boyandığını göstermiş oldum. Artık, boyayacağınız doku türlerine ve kullanacağınız antikorlara göre koşulları ayarlamak isteyeceksiniz.

Deneylerinizde başarılar dileriz.