Bir Chip Lensless Floresan Mikroskopi

Bu prosedürün genel amacı, ultra geniş bir görüş alanı üzerinden floresan nesneleri görüntülemek için merceksiz bir yonga üstü floresan mikroskopi platformunu göstermektir. Bunu başarmak için, ince bir absorpsiyon filtresi ve bir fiber optik yüz plakası, bir opto-elektrik sensör dizisinin veya CCD CMOS'un üzerine nazikçe yerleştirilir ve ardından bir mikroakışkan yonga yüz plakasının üzerine konumlandırılır. Sonrasında, indeks eşleştirme yağı kullanılarak mikroçip ile bir prizma birleştirilir.

Floresan uyarımı, bir romboid prizmanın yan yüzeyinden gerçekleştirilir ve holografik aydınlatma aynı prizmanın üst yüzeyinden yapılır. Nihayetinde, ham görüntüler dijital algoritmalar aracılığıyla çözümlenerek elde edilen floresan görüntülerden yüksek çözünürlüklü mikroskobik görüntüler elde edilebilir. Gerektiğinde, çözümlenen floresan nesneler özel olarak geliştirilmiş bir arayüz kullanılarak otomatik olarak sayılabilir.

Çip üzeri lens. Görüntüleme, genel olarak hantal lens tabanlı optik mikroskopları daha basit ve daha kompakt tasarımlarla değiştirmeyi amaçlamaktadır. Bu gelişmekte olan teknoloji platformu, yeni teoriler ve dijital rekonstrüksiyon algoritmalarının yardımıyla, hantal ve maliyetli optik bileşenlere duyulan ihtiyacı ortadan kaldırma potansiyeline sahiptir.

Yongadaki görüntüleme platformundaki lens listesi; dijital bir sensör dizisi, tutarsız bir aydınlatma kaynağı, bir prizma, bir absorbsiyon filtresi ve bir fiber optik yüz plakası veya bir fiber optik konik uç dahil olmak üzere çeşitli optik bileşenlerden oluşur. Bu platformda, hedef mikro nesnelerden gelen floresan sinyalin tespiti için farklı tipte sensör dizileri kullanılabilir. Bu videonun amaçları doğrultusunda, bir şarj bağlılı cihaz (charge coupled device) kullanılacak olup, floresan uyarımı için basit bir ışık yayan diyot gibi tutarsız bir ışık kaynağı kullanılır.

Bu diyagramda gösterildiği gibi, gerekli karanlık alan arka planını oluşturmak için iki farklı uyarım filtreleme yöntemi paralel olarak kullanılır. İlk olarak, ilgi duyulan numuneleri barındıran mikroakışkan çipin alt yüzeyinde tam iç yansıma veya TIR oluşturmak için bir cam prizma veya cam yarım küre kullanılır. Buna paralel olarak, TIR sürecine uymayan zayıf saçılmış uyarım ışıklarını gidermek için düşük maliyetli bir absorbsiyon filtresi kullanılır.

Bu iki mekanizma kullanılarak uyarılmanın başarıyla reddedilmesinin ardından, dedektör düzleminde yalnızca örneklerin floresan emisyonu elde edilir. Bu denli geniş bir dedeksiyon sayısal açıklığına rağmen, floresan sinyalinin uzaysal yayılımını tasarlamak ve daha iyi kontrol etmek amacıyla, sensör dizisindeki ham floresan lekeleri oldukça geniş hale gelir. Standart bir ön plaka alternatifi olarak, nesne ve sensör düzlemleri arasına fiber optik bir ön plaka yerleştirilecektir.

Üst yüzeyinde, alt yüzeyine kıyasla çok daha yüksek fiber optik kablo yoğunluğuna sahip olan konik bir fiber optik yüz plakası, büyütme yoluyla daha yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kullanılabilir. Bu platformda kullanılan mikroakışkan çipler, lenssiz on-çip görüntüleme platformunun kurulumuna başlamak için gerekli olan mikro kanalları oluşturmak amacıyla cam lamlar üzerine yerleştirilen polidimetilsiloks duvarlar kullanılarak üretilir. Öncelikle, optoelektronik sensör dizisinin örtü camını bir vakum kalemi kullanarak çıkarın ve detektör aktif alanının üzerine ince bir absorpsiyon filtresini nazikçe yerleştirin.

Bir fiber optik yüz plakasını bu absorbsiyon filtresinin üzerine yerleştirin. Ardından, üretilen mikroakışkan çipi doğrudan fiber optik dizisinin üzerine koyun. Son olarak, ara yüzeyin kırılma indisinin camın kırılma indisiyle eşleşmesini sağlamak için indeks eşleme yağı kullanarak mikroakışkan çipin üzerine bir cam prizma monte edin.

Işık kaynaklarını FC konnektörler kullanarak fiber optik kablolara bağlayın. Bu prosedürün en zor yönlerinden biri bileşenlerin hizalanmasıdır. Bileşenler arasındaki mesafeleri, aydınlatmanın konumunu ve açısını dikkatlice hizalayın.

Son olarak, yan aydınlatma fiberini prizmaya yaklaştırın ve mikroakışkan çiplerine karşılık gelen cam-hava arayüzünde tam iç yansıma gerçekleşmesini sağlamak için açısını ayarlayın. Bu çip üstü platform kullanılarak alt substrat, çeşitli hücreler veya küçük hayvan modelleri görüntülenip görüntülenebilir, ancak bu demonstrasyon kapsamında beyaz kan hücreleri görüntülenecektir. Beyaz kan hücrelerini floresan bir boya ile etiketlemek için önce yaklaşık 100 microliters tam kanı yaklaşık bir milliliter eritrosit yıkama tamponu ile karıştırın, oda sıcaklığında yaklaşık üç dakika inkübe edin ve ardından lizislenmiş kan çözeltisini santrifüjleyin.

Mikropipet kullanarak üst katmanı uzaklaştırdıktan sonra, hücrelerin nükleik asitlerini floresan boya ile işaretlemek için pelet katmanını fosfat tamponlu salinde yeniden süspande edin, yeniden süspansiyonla SYTO 16 ekleyin ve ardından örneği oda sıcaklığında, karanlıkta yaklaşık 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra, işaretlenmiş örneği santrifüjleyin. Bağlanmamış boyaların floresan emisyonundan kaynaklanan arka plan gürültüsünü azaltmak için süpernatanı uzaklaştırın.

Reese, beyaz kan hücresi pelet tabakasını yaklaşık beş mililitre PBS içinde çözündürdü. Örnek artık, lenzsiz çip üzeri floresan görüntüleme için mikroakışkan çipe yüklenmeye hazırdır. Beyaz kan hücrelerini görüntülemeden önce, görüntüleme platformu floresan mikroboncuklar kullanılarak kalibre edilmelidir.

Deiyonize su ve ham boncuk çözeltisi kullanarak seyreltilmiş mikroboncuk örneği hazırlayın. Keskin uçlu bir iğne şırınga kullanarak, bu başlangıç örneğini mikroakışkan çipe PDMS duvarların yan tarafından enjekte edin.

Çip üzerinde floresan görüntüleme sağlamak için bileşenleri birleştirdikten sonra, bilgisayar aracılığıyla özel olarak geliştirilen LabVIEW arayüzünü kullanarak floresan boncukların ham görüntülerini elde edin. Tüm görüş alanı boyunca en az 20 izole floresan boncuk görüntüsü olduğundan emin olun. Lenssiz floresan mikroskopi platformunun nokta yayılım fonksiyonunu (point spread function) kalibre etmek ve çıkarmak için daha sonra kullanılacak olan kalibrasyon verilerini kaydedin.

Floresan boncuk örneğini içeren mikroakışkan çipi çıkarın ve prizmayı bu çipten ayırın. Önceden hazırlanmış beyaz kan hücresi örneğini, PDMS duvarların yan tarafı üzerinden kullanılmamış başka bir mikroakışkan çipe enjekte edin. Bileşenleri, özellikle mesafeler ve uyarım gücü hususunda aynı deneysel koşullar altında yeniden birleştirin.

Floresan mikroboncuklar için kullanılan yazılım parametrelerinin aynısını kullanarak, özel yapım LabVIEW ile beyaz kan hücrelerinin ham görüntülerini elde edin. Ardından, kalibrasyon verileri ve ham beyaz kan hücresi görüntüleri, dijital işleme yoluyla MATLAB'da daha yüksek çözünürlüklü görüntüler oluşturmak için kullanılır. Karşılaştırma amacıyla, dört mikron ve 10 mikron boyutundaki yeşil floresan partiküller içeren bir karışımın geniş alan lensli çip üstü floresan görüntülemesine ait temsili sonuçlar burada gösterilmiştir, 10x mikroskop.

Gösterilen lenssiz floresan görüntülerle iyi bir uyum sergileyen objektif görüntüleri de sağlanmıştır. Ardından, 10 mikron yeşil ve 10 mikron kırmızı floresan partiküller içeren bir karışımın geniş alan lenssiz floresan görüntüleme sonuçları yer almaktadır. Lenssiz floresan görüntüler, aynı numunelerin 10 x mikroskop objektifi görüntüleriyle oldukça tutarlı bir eşleşme sağlamaktadır.

Bu şekil, çeşitli 10 mikronluk boncuk çiftlerinin görüntülenmesi için Lucy Richardson Dekonvolüsyonu ve çözme algoritmalarına dayalı sıkıştırmalı örneklemenin performans karşılaştırmasını sunmaktadır. Üst satır, ekteki görüntülerin 10 x objektif lens kullanılarak elde edilen aynı partiküllerin mikroskop karşılaştırmalarını gösterdiği lenssiz ham floresan görüntüleri örneklendirmektedir. Orta satır sıkıştırmalı çözme sonuçlarını gösterirken, alt satır Lucy Richardson Dekonvolüsyon sonuçlarını örneklendirmektedir; DDCS ve DLR sırasıyla merkezden merkeze mesafelere ve mikroskop görüntülerine, CS çözülmüş lens görüntülerine ve LR dekonvolüye edilmiş lenssiz görüntülere atıfta bulunmaktadır.

Ardından, lensin dijital işlenmesi ve daha az floresan içeren ham görüntülerin işlenme süreci gösterilmektedir. Yakın şekilde paketlenmiş iki mikron çapındaki boncuk çiftlerini çözümleyerek dört mikrondan daha düşük uzamsal çözünürlük elde etmek için sıkıştırmalı örnekleme tabanlı bir algoritma kullanılmıştır. Ek görseller, kod çözülmüş floresan görüntülerle oldukça uyumlu olan 40 x mikroskop objektifi karşılaştırmalarını göstermektedir.

Burada D, mikroskop görüntülerindeki merkezden merkeze uzaklıkları ifade eder. DCS ise CS kod çözümlü lenzsiz görüntülerdeki merkezden merkeze uzaklıkları ifade eder. Bu şekil, floresan ile işaretlenmiş beyaz kan hücrelerinin lenzsiz görüntüleme sonuçlarını göstermektedir.

Ham lenssiz görüntüler, 10 x objektif lens ile elde edilen aynı örneğin geleneksel mikroskop görüntüsüyle oldukça uyumlu sonuçlar veren CS tabanlı bir kod çözücü kullanılarak hızla çözümlenir. Gerektiğinde görüntülemenin yanı sıra, çözümlenen floresan nesneler, çip üstü sitometri uygulamaları için özel olarak geliştirilmiş bir arayüz kullanılarak otomatik olarak da sayılabilir. Burada, Matlab'da özel olarak tasarlanmış otomatik bir floresan nesne sayma arayüzü gösterilmiştir. Etiketlenmiş hücrelerin ve mikro boncukların sekiz santimetrekarelik bir görüş alanı üzerindeki lenssiz floresan mikroskopi prosedürünü göstermiş olduk.

Hızlı sıkıştırmalı kod çözücü destekli, benzer bir çip görüntüleme platformu. Bu platform; yüksek verimli sitometri, mikro nadir analiz ve gerçek hücre araştırma uygulamaları için oldukça değişken olacaktır.