RNA Yapısı 'peroksidatif' ve 'Oksidatif' Hidroksil Radikal footprinting İzleme Denge Değişiklikler

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hidroksil radikali ayak izi yöntemiyle RNA moleküllerinin nasıl katlandığını belirlemektir. Bu işlem; RNA'nın uç etiketlemesi, jel saflaştırması ve ön katlamasıyla gerçekleştirilir; bu adımlar, sonraki aşama olan magnezyum aracılı katlanma öncesinde RNA'nın konformasyonel bütünlüğünü sağlar. Ardından, çözücüye erişilebilirliğine göre RNA omurgasını kesebilen hidroksil radikalleri üretmek için Fenton reaktifleri karıştırılır. Son olarak, RNA kesilme ürünleri denatüre poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrılır ve otoradyografi ile görüntülenir.

Bant integralleri, yarı otomatik ayak izi analiz yazılımı ile nicelendirilir. Nihai hedef, RNA'nın tersiyer yapı oluşumunu yansıtan katlanma izotermleri oluşturmaktır. Bu, normalize edilmiş bant integrallerinin kısmi doygunluğa ölçeklendirilmesiyle gerçekleştirilir.

İzotermler daha sonra hill denklemine uydurulabilir. Hidroksi ayak izi yönteminin temel avantajı, küçük boyutları nedeniyle yüksek aktiviteye sahip olan hidroksil radikallerinin, solvente açık ve gömülü nükleotidleri ayırt etmek için mükemmel problar olması sayesinde, uygun maliyetli kimyasallar kullanarak RNA'nın tersiyer yapı bilgilerini elde edebilmenizdir. Bu yöntem, RNA yapısal biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Örneğin, ribozomlar aktif konformasyonlarına ulaşmak için metal iyonlarını nasıl kullanırlar? Hidroksil radikali ayak izi yöntemi, RNA özgüllüğünün ve tanınmasının temellerini anlamak için kullanılabilir. Bu yöntem, RNA tersiyer yapısı hakkında bilgi vermenin yanı sıra, RNA veya DNA moleküllerindeki kesin protein bağlanma bölgelerinin belirlenmesinde de kullanılabilir.

Bu yöntemin başlıca zorlukları, örneğin ribonükleaz tarafından yıkıma uğramasını önlemek ve doğru miktarda RNA kesimi elde etmek için demir konsantrasyonunu optimize etmektir. Ayrıca, bant aralıklarının ayrıntılı analizi oldukça karmaşık olabilir. Bu videonun temel amacı, izleyicilerin hidroksil radikali ayak izi deneyinin planlama aşamalarını ve başarılı bir şekilde yürütülmesini anlamalarına yardımcı olmaktır. Bu protokole başlamadan önce, yazılı protokolde açıklandığı şekilde tüm ayak izi reaktiflerini hazırlayın.

Bu videonun eşliğinde, RNA'lar orada belirtildiği üzere dört ilgili DFO ile üretilebilir ve uçları işaretlenebilir. Radyoaktif olarak işaretlenmiş RNA'yı denatüre eden jel elektroforezi kullanarak saflaştırın. Saflaştırılmış RNA'yı, 0,3 molar sodyum asetat kullanarak birbirini izleyen iki jel ekstraksiyonu ile geri kazanın.

Ardından, 0,5 mililitre sulu çözeltiyi bir mililitre etanolle karıştırarak RNA'yı çöktürün. Karışımı kuru buz üzerinde bir dakika boyunca inkübe edin. Numuneyi santrifüjledikten sonra süpernatantı atın. RNA peletini %70 etanol ile yıkayın.

Ek santrifüjasyon sonrası süpernatantı uzaklaştırın ve peleti vakumda kurutun. Ardından, saflaştırılmış P 32 işaretli RNA örneklerini çözün. Yeni bir reaksiyon tüpüne, bir kat reaksiyon tamponunun 330 mikrolitresi içinde 30 mikrolitre RNA çözeltisi pipetleyin.

RNA'yı etanol ile çöktürün ve ardından peleti vakumda kurutun; kurutulduğunda bu pelet, yazılı prosedürde açıklandığı üzere referans merdiveni oluşturmak için kullanılabilir; geri kalan tamponlu RNA çözeltisini 95 °C'de iki dakika ısıtarak denatüre edin. Örnekları 15 dakika boyunca oda sıcaklığına getirin ve kondensatı tekrar çözeltiye döndürmek için hızlı bir santrifüj işlemi uygulayın. Ayak izi (footprint) deneyine başlamak için, 30 kuyucuklu bir elektroforez jelini doldurmaya yetecek kadar örnekle 27 reaksiyon tüpü hazırlayın.

Merdivenler ve kesilmiş kontrol dahil edildikten sonra, titrasyon orta noktası etrafındaki birkaç büyüklük sırasına logaritmik ölçekte eşit aralıklarla dağılacak şekilde nihai magnezyum iyon konsantrasyonlarını belirleyin; bir katlık reaksiyon tamponu içindeki magnezyum iyonlarının hazırlanışı metinde ayrıca açıklanmıştır. RNA ve magnezyum iyon çözeltilerini 50 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin. Ardından, 10 µL RNA çözeltisini, ilgili miktardaki 90 µL magnezyum iyon çözeltisi ile karıştırın.

Toplam 100 µL hacme ulaşmak için, her karışımı 50 °C'de 30 dakika inkübe edin. Ardından, RNA katlanmasının gerçekleşmesi için solüsyonların 25 °C'de bir saat boyunca dengelenmesini sağlayın. Bu sırada, hidroksil radikali ayak izi reaksiyonunu başlatmadan hemen önce, yazılı protokolde açıklandığı şekilde kontrol reaksiyon karışımını hazırlayın.

RNA solüsyonu içeren reaksiyon tüpünün üst iç kısmına, birbirine temas etmeyecek şekilde ikişer mikrolitre demir EDTA, sodyum askorbat ve hidrojen peroksit damlacıkları pipetleyerek peroksidasyon reaksiyonunu hazırlayın. Şiddetli bir şekilde karıştırarak footprinting reaksiyonunu başlatın. 15 saniye sonra, 300 mikrolitre saf soğuk etanol ekleyerek reaksiyonu durdurun.

Tüpleri üç ila beş kez altüst edin. Son olarak, peleti daha önce gerçekleştirildiği gibi çöktürün, yıkayın ve kurutun; peroksidatif reaksiyona alternatif olarak, örneklere taze hazırlanmış beş mikrolitre Fenton reaksiyon karışımı ekleyerek oksidatif hidroksil reaksiyonu gerçekleştirilecektir. Oksidatif reaksiyonu 25 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, reaksiyonu durdurmak için 300 µL saf soğuk etanol ekleyin ve tüpleri çevirerek karıştırın. Tekrar çöktürün. Peroksidatif veya oksidatif reaksiyon tamamlandığında pelleti yıkayın ve kurutun.

Kurutulmuş RNA peletlerini sekiz µL jel yükleme boyası iki içerisinde çözün. P 32 işaretli RNA'nın yeniden süspande edildiğini bir geiger sayacı kullanarak doğrulayın; standart protokollere uygun olarak denatüre edici %8 poliakrilamid sekanslama jeli hazırlayın. 30 kuyucuklu bir tarak kullanarak, iki referans ve bir kesilmiş kontrol dahil olmak üzere örnekleri yükleyin.

RNA fragmanlarını 60 ila 75 watt'ta iki buçuk saat boyunca ayırın. Kurutulmuş jeli gece boyunca bir saklama fosfor ekranına maruz bırakın. Filmsız otoradyografi için fosfor ekranını bir görüntüleme sistemiyle tarayın.

Ardından, analiz için jel görüntü dosyasını bilgisayara aktarın. Veri analizine başlamak için, tek bant uydurma ve miktar tayini için kullanılan açık kaynaklı yazılım olan Safa'yı açın. Önce RNA dizisini .txt dosyası olarak, ardından jel görüntüsünü .gel dosyası olarak yükleyin.

Şeritleri tanımlayın ve bant yoğunluklarını ayarlayın. Ardından bir çapa şeridi seçin ve RNA T-1 sindirim merdivenine referansla bantların nükleotidlere jel hizalama atamasını gerçekleştirin. Bant yoğunluklarını nicelleştirin; potansiyel olarak değişmez kalıntıları normalize etmek ve atamak için normalizasyon/renk grafiği özelliğini kullanın.

Çıktıyı bir txt dosyası olarak kaydedin. SFA, jel üzerindeki şeritleri temsil eden sütunlar ve RNA fragmanına karşılık gelen bireysel bant integrallerini temsil eden satırlar içeren bir hesap çizelgesi verir. İlk olarak, magnezyum iyonu içermeyen örnekten elde edilen koruma profili ile uç nokta magnezyum iyonu konsantrasyonu profilinin karşılaştırılmasıyla, solvent erişilebilirliğinde belirgin bir değişiklik gösteren koruma bölgeleri belirlenmelidir.

Değer ne kadar düşükse, nükleotid hidroksil radikallerinin saldırısına karşı o kadar korunaklıdır ve bunun tersi de geçerlidir. Ardından, bir hesap çizelgesi formatı kullanarak, tekil veya grup halindeki nükleotidlerin bant yoğunluklarına karşı magnezyum demir konsantrasyonunu gösteren geçiş eğrileri oluşturun; bu geçişleri, bu protokolün metin kısmında açıklandığı şekilde fraksiyonel doygunluk fonksiyonuna göre ayrı ayrı ölçeklendirin. Son adım olarak, verileri Hill denklemine uydurun.

Bu analiz, geçişi kısmi doygunluğa ölçeklendirir, geçiş orta noktasını belirler ve gösterilen geçişin sigmoid yapıda olup olmadığına dair fenomenolojik bir test sağlar. Burada, P dört P altı RRNA hidroksil radikali ayak izi deneylerinden elde edilen temsili sonuçlar yer almaktadır. İzotermler, Safa tarafından analiz edilen sekanslama jellerinden türetilmiş ve ardından analiz bölümünde açıklandığı şekilde sığdırılmıştır.

Jel görüntüsü, arka plan cleavage düzeyinin minimumda olduğunu ve T şeridindeki belirgin bantlar sayesinde tek nükleotid atamasının mümkün olduğunu göstermektedir. Hidroksil radikali tarafından tetiklenen RNA fragmantasyonu, arka plan düzeyinin oldukça üzerindedir. Düşükten yükseğe magnezyum iyonlarına geçiş, RNA oluşumuna işaret eden münferit bantların ve bant gruplarının yoğunluğundaki azalma ile seçici olarak ilişkilidir.

Tersiyer yapı koruması, kesilmeleri eş zamanlı olarak bant yoğunluklarını değiştiren tekil nükleotidleri veya ardışık nükleotid gruplarını ifade eder; bu yoğunluklar saffer analizi ile nicelendirilir ve normalize edilir. Çıktı, hidroksil radikallerine karşı koruma derecesini görselleştiren termal bir grafiktir. Renk geçişi, magnezyum demir eklemesi üzerine meydana gelen erişilebilirlik değişimini tanımlar; beyazdan kırmızıya geçiş daha erişilebilir nükleotidleri, beyazdan maviye geçiş ise daha korunaklı nükleotidleri gösterir.

Her bir gölgelendirme derecesi, bir koruma eğrisi olarak çizilebilen ve Hill denklemi gibi bir bağlanma modeliyle analiz edilebilen sayısal bir değerle ilişkilendirilmiştir. Bu örnekte, protection 1 5 3 ile 1 5 5 arasındaki koruma ile ilişkili denge disosiyasyon sabiti, protection 1 6 3 ile 1 6 4 arasındaki karşılık gelen değerin yaklaşık iki katıdır. Bu hidroksil radikali ayak izi deneyi, uygun şekilde gerçekleştirilirse bir buçuk günde tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, herhangi bir RNA kontaminasyonunu önlemek için eldiven ve laboratuvar önlüğü giymeyi unutmamak önemlidir. Ayrıca, nihai demir konsantrasyonu deneysel sisteme bağlıdır. Bu nedenle, bu prosedürü takip eden footprinting işlemi öncesinde bir doz yanıt deneyi gerçekleştirmenizi öneririz.

Ek soruları yanıtlamak için zaman çözünürlüklü hidroksil radikal ayak izi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Örneğin, RNA molekülleri gelişimlerini takiben hangi kritik zaman noktasında yanlış katlanmış veya aktif bir konformasyona ulaşır? Bu teknik, yapısal biyoloji alanındaki araştırmacıların nükleik asitlerin hem ara hem de geçici moleküler tersiyer etkileşimlerini keşfetmelerinin yolunu açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, RNA moleküllerinin tersiyer yapı oluşumunun nasıl belirleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Eldiven ve koruyucu gözlük takmak gibi tehlikeli maddelere karşı önlemlerin yanı sıra, bu prosedürü gerçekleştirirken pleksiglas koruyucu kullanmanız önerilmektedir.