İşleme Loblolly Çam PtGen2 cDNA Mikroarray

Bu video, Georgia Üniversitesi Warnell Ormancılık ve Doğal Kaynaklar Okulu'ndaki araştırmacılar tarafından üretilmiştir. Bu eğitim videosunun amacı, hibritleşme öncesinde ve sonrasında dizinin yıkanmasına ve taşınmasına özel dikkat göstererek, LOB lolly pine pt, gen iki CDNA mikro-dizimizin nasıl işleneceğini detaylandırmaktır. Genel olarak protokollerimiz, dizilerimizin basıldığı Institute for Genomic Research Tiger ve Vanderbilt Mikro-dizi Ortak Kaynak Tesisi'nde (VMSR) geliştirilen protokolleri takip etmektedir.

Sinyal kalitesinin tekdüzeliği ve düşük arka plan konusunda en yüksek düzeyde tutarlılık sağlamak için PT Gen two'nun daha sıkı bir işlemden geçirilmesi gerektiğini saptadık. İlk adım ön yıkamadır. Spotlama tamponumuz çok yüksek tuz içeriğine sahip olduğu için bu ön yıkama, söz konusu tuzu uzaklaştırmak amacıyla gereklidir.

Lamlar bir mikroskop lam taşıyıcısına yerleştirilir ve 43 dereceye önceden ısıtılmış %0,2 SDS çözeltisine 15 ila 20 kez kuvvetlice daldırılır. SDS çözeltisinde yıkandıktan sonra lamlar, pensle dikkatlice alınarak hibridizasyon öncesi tamponu içeren bir Copeland kavanozuna aktarılır. Bu tampon; 5X SSC, %0,1 SDS ve %1 BSA içerir ve aynı şekilde 43 derecede ısıtılır.

Copeland kavanozu parfüme batırılarak kapatılır ve bir saat boyunca 43 °C'lik bir inkübatöre yerleştirilir. Ön hibritleşmenin ardından lamlar bir mikroskop lam taşıyıcısına alınır ve her birinde 15 ila 20 kez daldırılarak ardışık olarak beş kez deiyonize su ile yıkanır. Son olarak lamlar izopropanole yerleştirilir, beş veya altı kez daldırılır ve ardından bir chip M mate santrifüjle kurutulana kadar santrifüj edilir.

Santrifüj işleminden sonra, lamlara 0,2 mikronluk bir filtreden geçirilmiş basınçlı hava tutulur. Ardından lamların üzerine, yine basınçlı hava ile temizlenmiş olan kaldırma lamları yerleştirilir ve kaldırma lamını lam üzerindeki doğru konuma getirmek için küçük bir pipet ucu kullanılır.

Kaldırıcı şeritler yerleştirildikten sonra, ancak hibridizasyon tamponu eklenmeden önce, odacığın uçlarında bulunan nem kuyucuklarına 20 µL 100 mM dihi, three atol ekliyoruz. Artık, hibridizasyon tamponunda yeniden süspande edilmiş olan hedef cDNA'ları eklemeye hazırız. Pipet ucu, kaldırıcı şeridin ve lamın kenarına yerleştirilir ve çözelti yavaşça pipetlenir.

Dizileri yüklemek için kılcal etkiyi kullanmanın en yüksek tutarlılığı sağladığını ve istenmeyen hava kabarcıklarının oluşumunu önemli ölçüde azalttığını saptadık. Hedef materyal diziye eklendikten sonra, hibridizasyon odası monte edilir ve alüminyum folyo ile kapatılır. Ardından hibridizasyon odası, genellikle 14 ila 16 saat süren gece boyu inkübasyon için çalkalayıcı bir su banyosuna yerleştirilir.

Su banyosu 48 dereceye ve çalkalayıcı 50 rpm'e ayarlanır. Hibritleme solüsyonunun eklendiği andan itibaren tüm hibrit sonrası yıkama işlemleri boyunca, foto-oksidasyonu önlemek için prosedürlerin düşük ışıkta gerçekleştirildiğini belirtmek önemlidir. Ertesi gün, lamlar hibritleme haznesinden çıkarılır ve 53 dereceye önceden ısıtılmış olan birinci yıkama solüsyonunu içeren bir Copeland kavanozuna yerleştirilir.

Slaytların, kaldırıcı şeritler dökülene kadar yaklaşık bir dakika boyunca Copeland kavanozunda kalmasına izin verilir; bu noktada slaytlar pensle nazikçe çıkarılır ve yıkama işlemlerine geçmek üzere bir mikroskop slayt taşıyıcısına yerleştirilir. Ardından slaytlar, yine 53 °C'de birinci yıkama çözeltisi içeren ikinci bir kaba yaklaşık 15 ila 20 kez kuvvetlice daldırılır. Kap daha sonra parafilm ile kapatılır ve 53 °C'ye ve 100 RPM'e ayarlanmış bir inkübatör hava çalkalayıcıya yerleştirilir.

10 dakikalık inkübasyon ve 1 numaralı yıkama solüsyonundan sonra, lamlar oda sıcaklığındaki 2 numaralı yıkama solüsyonu içeren bir kaba 15 ila 20 kez kuvvetlice daldırılır. Kap parafilm ile kapatılır ve 10 dakikalık bir inkübasyon için oda sıcaklığında tekrar bir çalkalayıcıya yerleştirilir. Son olarak, lamlar 2 numaralı yıkama solüsyonundan çıkarılır ve 3 numaralı yıkama solüsyonu içeren bir kaba 15 ila 20 kez kuvvetlice daldırılır.

Lamlar daha sonra Parafilm ile kapatılmış üçüncü yıkama çözeltisi içeren ikinci bir kaba alınır ve tekrar 10 dakika boyunca çalkalayıcıya yerleştirilir. Son yıkamanın ardından, tam kuruma sağlamak için lamları santrifüj ederiz. Bunu yapmak için, 50 ml'lik konik tüpün içine 15 ml'lik bir Falcon kapak yerleştiririz ve dizileri barkod tarafı aşağı gelecek şekilde konik tüpe koyarız.

Ardından tüpler, oda sıcaklığında 1500 RPM hızında, salınımlı kova rotorlu bir santrifüjde döndürülür. Santrifüjden sonra lamlar, alüminyum folyo ile kaplanmış ikinci bir 50 ml'lik konik tüp setine aktarılır. Daha sonra tüpler, 0.22 mikronluk bir filtreden geçirilmiş azot gazı ile temizlenir ve taşıma için veya tarama işlemine kadar saklanmak üzere kapatılır.

Tarama verilerini bir PerkinElmer scan array 5, 000 cihazı ile topluyoruz. Array görüntüsü ızgaralandırılır, ham tarama verileri işlenir ve ilk veri analizi bio discovery'nin görüntüleme yazılım paketi ile gerçekleştirilir. Ardından, spot sinyal yoğunluğu verileri normalize edilir ve istatistiksel analizler, National Cancer Institute üzerinden indirilebilen, güçlü ve ücretsiz bir microarray istatistik paketi olan BRB array tools ile yapılır.

Diğer istatistiksel analizler ve gen ekspresyon paterni aramaları, ücretsiz olarak sunulan web tabanlı bir analiz paketi olan gen ekspresyon paterni ve analiz seti Jeep PPAs ile gerçekleştirilir. Lob lolly çamı PT Gen iki mikro-diziliminin nasıl işleneceğine dair videomuzu izlediğiniz için teşekkür ederiz.

Aşağıdaki kişiler, bu eğitim videosunun içeriğinden ve prodüksiyonundan sorumludur.