Oligonükleotid çiftli Floresan Mikroküreler kullanarak Kompleksi Klinik ve Çevre Örneklerinde Bakterilerin Multiplex Algılama

Merhaba, ben Agriculture and AgriFood Canada'dan Tim Duso. Bu videoda, bir bio plex cihazı kullanarak kompleks bir klinik veya çevresel örnekteki spesifik mikroorganizmaların varlığını ve bolluğunu belirlemeye yönelik bir protokolü göstereceğiz. Bu protokol, türe özgü bir oligonükleotid probuna kimyasal olarak bağlanmış floresan polistiren boncuklar kullanmaktadır.

Evrensel PCR primerleri kullanılarak örnekten bir amplikon üretilir ve bu amplikon, prob bağlı boncuklarla hibridize edilir. Bio-plex cihazı ile iki sinyal üretilir. Bunlardan biri boncuğu tanımlarken, diğeri hibridizasyon sinyalini nicelleştirir.

Prosedürün genel amacı, ilgilenilen mikrobiyotanın profilini hızlı ve yarı nicel bir şekilde belirlemektir. Bu tekniği, vajinal sürüntülerdeki bakteriyel profilleri belirlemek ve elde edilen verileri, laktobasil organizmalarının daha az yaygın hale geldiği ve Gardnerella, vais ve apoian vae gibi diğer organizmaların vajinal sürüntülerde tespit edilebilir olduğu bir mikrobiyota değişimi ile karakterize edilen klinik bir durum olan bakteriyel vajinozis teşhisini koymak için uyguladık. Ancak, bu tekniğin hızlı bir multipleks assay'inle istendiği diğer tüm mikrobiyotalar için de uygulanabileceğini unutmamak önemlidir.

İşlemin nasıl çalıştığını açıklayarak başlayalım. Sürüntüden elde edilen bir DNA özütündeki tüm organizmalarda bulunan bir protein ve kaplama gen şaperonu 60'ın amplifikasyonu ile bir mikrobiyal profil oluşturulur. Evrensel amplifikasyon primerlerinden biri, biyotin eklenmesinin yanı sıra fosfat modifiyeli bazların dahil edilmesiyle modifiye edilmiştir.

Beşinci prime ucunda, amplikon, yalnızca antisens zincirini degrade eden T seven ekzonükleaz kullanılarak tek zincirli hale getirilir. Sens zinciri, fosfat modifiyeli bir PCR primeri tarafından korunduğundan, kalan zincire tamamlayıcı olan oligonükleotid probları floresan polistiren boncuklara kovalent olarak bağlanır. Her benzersiz boncuk rengi farklı bir organizmayı tespit eden bir prob içerdiğinden, tek bir örnek için yüze kadar farklı boncuk kullanılabilir.

Vajinal sürüntüden elde edilen tek zincirli PCR ürünü, ilgilenilen tüm organizmalar için problar içeren problı boncuk karışımı ile hibritlenir. Streptavidin konjuge aracılığıyla biyotinlenmiş problara bağlanan floresan bir raporlayıcı olan FICO etin eklenir. Son olarak, hibridizasyon karışımı, her bir boncuğu kimlik ve hibridizasyon sinyali açısından tek tek inceleyen bir luminex veya bio plex cihazında analiz edilir.

Bu analizin sonuçları, belirli mikroorganizmaların varlığını göstermekte olup hibridizasyon sinyalinin yoğunluğu, o organizmanın bolluğu ile korelasyon göstermektedir. Örnekte, BV ile ilişkili organizmaların varlığı bv tanısı koymak için kullanılabilir. Bu tekniğin gram boyama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, belirli mikroorganizmaların varlığı ve bolluğu hakkında bilgi üretilmesidir.

Prosedürü, laboratuvarımızda araştırma görevlisi olan Jennifer Townle gerçekleştireceğiz. Mikrosferleri yaklaşık 20 saniye boyunca vorteksleyerek yeniden süspanse edin. 400 µL mikrosferi bir Eppendorf tüpüne aktarın ve 14.000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin, ardından üst fazı uzaklaştırıp atın. Mikrosferleri 50 µL 0,1 M MES pH 4,5 içerisinde yeniden süspanse edin.

Mikrosferlere bir miktar yakalama oligosu ekleyin ve vorteksleyerek karıştırın. Mikrosferlere 2,5 µL taze EDC çözeltisi ekleyin. Reaksiyonu oda sıcaklığında, karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin.

Daha önce hazırlanan EDC çözeltisini atın ve suda 10 mg/mL EDC içeren taze bir örnek hazırlayın. Yukarıda olduğu gibi, mikrokürelere 2,5 µL taze EDC çözeltisi daha ekleyin ve beş saniye boyunca vorteksleyin. Karanlıkta, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca tekrar inkübe edin.

Boncukları 1 mL %0,02 Tween 20 ekleyerek yıkayın, boncukları yeniden süspande etmek için vorteksleyin ve 14.000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin, ardından süpernatantı uzaklaştırıp atın. Boncukları tekrar 1 mL %0,1 SDS ekleyerek yıkayın. Boncukları 100 µL TE tamponunda süspande edin.

Stok konsantrasyonunu belirlemek için boncukları bir hemositometre ile sayın. Her bir boncuğu te tamponunda mikrolitre başına 100 boncuk nihai konsantrasyonuna seyrelterek bir mikroküre master mix hazırlayın; eşleşmiş boncukları deneyin istenen pleksine göre birleştirin. Mikroküre master mix'ini dört derecede, karanlıkta saklayın. Bu koşullar altında tutulduğunda, bu karışım aylarca saklanabilir; her bir örnek için PCR ürünü oluşturun.

PCR tamamlandıktan hemen sonra fosfolat ve biyotin modifiyeli beş prime primer setini ekleyin. Her bir PCR tüpüne iki mikrolitre T7 eksonükleaz ekleyip oda sıcaklığında 40 dakika boyunca inkübe edin. Bu inkübasyonun sonunda, karışıma 12,5 mikrolitre 0,5 molar EDTA pH 8.0 ekleyin.

Bu, toplamda yaklaşık 64.5 µL tek zincirli PCR ürünü sağlar. Resus Bend Mikrosfer master mix'i bir pipetle yeniden süspande edin. Bir eppendorf tüpüne uygun miktarda dağıtın.

Tüpün kapağını kapatın ve bir benmari sonikatöründe iki dakika boyunca sonikasyon uygulayın. Tek zincirli PCR ürününden 17 µL'yi düşük profilli 96 kuyucuklu plakadaki uygun kuyucuklara dağıtın ve her birine 33 µL resüspande edilmiş sonike boncuk karışımı ekleyin.

Plakayı silikon bir kapakla kapatın ve hafifçe vurun. Plakayı; 5 dakika 95 derece, 10 dakika 60 derece, 60 derecede bekletme veya 5 dakika 60 derecede duraklatma şeklinde programlanmış bir termosikletöre nazikçe yerleştirin. Programı başlatın.

Taze strep Aden FICO Ethin çözeltisi hazırlayın. Kuyucuk başına 25 µL gerekecektir. Stok çözeltiyi 1 mg/mL olacak şekilde seyrelterek strep ve FICO ethin hazırlayın.

1x tmac tamponu ile mililitre başına 20 ile 50 mikrogram arasında bir konsantrasyon hazırlayın. Termosiklet cihazı 60 derece bekletme adımına geldiğinde kapağı açın, silikon kapağı kaldırın ve her bir kuyucuğa doğrudan strep din FICO ethin solüsyonu ekleyin. Silikon kapağı geri yerleştirin, termosiklet kapağını kapatın ve programı yeniden başlatın.

Program tamamlandığında, plakayı çıkarın ve okuma yapmak üzere hızlıca Bio-Plex cihazına aktarın. Plaka 10 dakika içinde okunmalıdır. Plakayı 60 °C'de okuyun.

Bio plex cihazının bu sıcaklığa önceden ısıtıldığından emin olun. Burada, tek bir bireyden zaman sıfırında alınan boylamsal örneklerin ilgili gram boyama ve Luminex profillerinin sonuçları gösterilmektedir. Gram boyama, BV klinik tanısıyla uyumludur ve bu durum, Gardner Relic, vais ve Apoian Vae dahil olmak üzere BV ile ilişkili organizmalar için pozitif hibridizasyon sinyalleri gösteren Fiveplex Luminex analizi ile doğrulanmaktadır.

Zaman ilerledikçe Lactobacillus Iners düşük seviyelerde tespit edilmektedir. Gram boyamaların gösterdiği üzere, bu birey BV mikrobiyotasından normal mikrobiyotaya geçiş yapmaktadır. Aynı örneklerin Luminex analizi, Gardnerella Vaginalis bolluğunun zirveye ulaşıp azaldığını, Lactobacillus Iners'in ise artarak son zaman noktasında baskın organizma haline geldiğini göstermektedir.

Mikrobiyota profilleme için bu yöntem kullanılarak, belirli organizmaların varlığına ve bolluğuna dair bilgiler oluşturulur. Yöntem sekans tabanlı olduğu için, prob tasarımı derin sekanslama analiziyle desteklenebilir ve yeni nesil sekanslama yöntemleriyle tanımlanan mikroorganizmalar, örneklerde hızlı ve nispeten düşük maliyetli bir şekilde takip edilebilir. Bu videoyu izlemek, Luminex veya Bio Plex cihazı kullanılarak bir örnekten mikrobiyal profilin nasıl oluşturulacağı konusunda size iyi bir anlayış kazandırmış olmalıdır.

Oligonükleotit problarının floresan boncuklarla nasıl eşleneceğini, klinik veya çevresel bir örnekten tek zincirli alikonun nasıl üretileceğini, hibridizasyonun nasıl gerçekleştirileceğini ve sonuçların Luminex veya Bio Plex cihazında nasıl belirleneceğini gösterdik. Deneylerinizde başarılar dileriz.