Yüksek Sıralı Nanosheets Peptoid Polimerler ve Self-Meclis Solid-faz Submonomer Sentezi

Bu prosedürün genel amacı, katı faz peptit sentezi ve peptitlerin yüksek derecede düzenli nano tabakalar halinde sulu ortamda kendi kendine montajı için basit ve verimli bir yöntemi tanımlamaktır. Polipeptitlere yapısal olarak benzer olan peptitler, yan zincirlerin alfa karbonu yerine azota bağlı olduğu sübstitüe glisin polimerleridir. Süreç, diğer alt monomer yöntemi aracılığıyla belirli bir peptit dizisinin sentezlenmesiyle başlar.

Alt monomer yöntemi, her bir monomerin zincire sırayla eklenmesini sağlayan iki basit kimyasal adımdan oluşur. İlk olarak, katı bir desteğe bağlı olan amin bromo asetillenir. İkinci olarak, bromür bir primer amin ile yer değiştirir.

Bu adımlar, istenen zincir uzunluğuna ulaşılana kadar tekrarlanır. Zincir uzamasının ardından peptit, katı destekten ayrılır ve elde edilen ham peptit yağı, peptitlerin nano tabakalar halinde kendi kendine düzenlenmesini başlatmak amacıyla HPLC ile saflaştırılarak karakterize edilir. Peptidin seyreltik bir sulu tampon çözeltisi cam bir şişede hazırlanır ve nazikçe karıştırılır. Son adım olarak.

Nano tabakalar mikroskop altında incelenir. Sonuçlar, iki basit kimyasal adımdan oluşan tekrarlayan bir döngünün, kendiliğinden nano tabakalara şeklinde kendi kendine organize olan diziye özgü bir polimer üretebileceğini göstermektedir. Peptitler, özellikleri proteinler ile geleneksel polimerler arasında olan, biyolojik ilhamlı yeni bir polimer sınıfıdır.

Geleneksel polimerler gibi dayanıklı ve sentetik olarak çok yönlü olan, ancak proteinler ve DNA gibi yüksek derecede ayarlanabilir ve sekans spesifik olan peptidler; biyoaktif ilaçların tanımlanması veya yapay proteinlerin tasarımı gibi biyotıp ve malzeme bilimindeki temel sorunları çözmek için gelişmiş bir malzeme olarak ortaya çıkmaktadır. Peptidlerin temel avantajları arasında hassas sekans kontrolü, inanılmaz derecede çeşitli yapı taşlarının mevcudiyeti, verimli sentez ve proteaz stabilitesi yer alır. Temel ekipmanlar ve ticari olarak temin edilebilen reaktifleri içeren genel peptid manuel sentez yöntemi, peptidlerin çoğu laboratuvarda kolayca sentezlenmesine olanak sağlayacak şekilde ana hatlarıyla açıklanmıştır.

Sentetik adımların görsel gösterimi kritik öneme sahiptir ve katı faz sentezi alanına giren kişiler için değerli bir referans kaynağı oluşturur. Burada ilk kez, amfifilik bir 36'lı peptid saflaştırması ve karakterizasyonu ile bu peptidlerin yüksek derecede düzenli nano tabakalar halinde kendi kendine birleşimi açıklanmaktadır. Bu protokole, yazılı protokolde belirtilen deneysel düzeneğin kurulmasıyla başlayın.

Netlik sağlamak amacıyla, aşağıdaki adımlar tek kullanımlık polipropilen fritli kartuş yerine cam bir reaksiyon kabında gerçekleştirilecektir. 100 mg R amit reçinesinin fritli bir reaksiyon kabına yerleştirilmesinin ardından, iki mL dimetil formamid veya DMF ekleyerek reçineyi şişirin ve 10 dakika boyunca kabarcıklandırma yoluyla karıştırın. Ardından, şişmiş reçineyi izole etmek için çözeltiyi vakumla süzün.

Ardından, FM O grubunu korumasız hale getirmek için DMF içinde %20'lik full metil piridin'den bir mililitre ekleyin. İki dakika boyunca karıştırın ve süzün. Bu işlemi 12 dakika boyunca tekrarlayın, ardından reçineyi iki mililitre DMF ekleyip 15 saniye karıştırıp süzerek durulayın.

Bromoasetilasyon ve yer değiştirme adımlarını içeren ilk alt monomer döngüsü ile peptit zincirinin büyütülmesine başlayın. Bromoasetilasyon için, DMF içerisinde 0,6 molar bromoasetik asitten bir mililitre ve 86 mikrolitre diizopropilkarbamid ekleyin. 30 dakika boyunca karıştırıldıktan sonra, sıvıyı boşaltın ve iki mililitre DMF ile durulayın.

Ardından, N-metilpiroglutamat içindeki bir ila iki molar aminden bir mililitre ekleyerek yer değiştirme işlemini gerçekleştirin ve 30 ila 120 dakika inkübe edin; inkübasyonun ardından boşaltın ve iki mililitre DMF ile durulayın. Ardından, alt monomer döngüsünü tekrarlayarak peptit zincirini büyütmeye devam edin. Son yer değiştirme işlemi tamamlandıktan sonra iki mililitre DMF ile durulayın.

Bunu bir diora metan yıkama kapağıyla takip edin ve reaksiyon kabını kesim işlemine kadar saklayın. Kesim işlemine başlamak için, tüm kurutulmuş reçineyi bir çeker ocak içinde ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanarak 20 milliliter'lik bir sintilasyon cam şişesine aktarın; sintilasyon cam şişesine dört milliliter trifloroasetik asit veya TFA kesim kokteyli ekleyin ve kapağını kapatın. Oda sıcaklığında 10 dakika ile iki saat arasında sıkıca karıştırın.

Alternatif olarak, çözeltiyi karıştırmak için döner bir çalkalayıcı kullanın. Reçineyi tek kullanımlık polipropilen sinterli bir kartuş aracılığıyla önceden tartılmış yeni bir 20 mililitrelik sintilasyon cam şişesine süzerek TFA cleavage çözeltisini toplayın. Ardından, reçineyi durulamak ve kalan peptidleri toplamak için bir mililitre taze cleavage kokteyli ekleyin.

Bu işlemi iki kez durulayarak tekrarlayın. TFA'yı, hafif bir nitrojen akımı üfleyerek veya bir biot charge V 10 evaporatör kullanarak uçurun; ardından ham yağı, bir bir oranında asetonitril ve su içeren altı mililitre çözeltide çözün.

Ardından örneği dondurun ve liyofilize edin. Bu işlem, ikinci liyofilizasyonun ardından bir kez daha tekrarlanmalıdır. Ham ürünün ağırlığını kaydedin ve ürünü -20 °C'de kuru toz olarak saklayın; saflık kontrolünü modifiye analitik HPLC ve/veya elektrospray LCMS kombinasyonu ile gerçekleştirin.

Ham ürünün saflığı ve istenen moleküler ağırlığın mevcut olup olmadığı, metinde belirtilen prosedürler takip edilerek belirlenebilir. Ham peptit karışımı daha sonra yazılı prosedüre uygun olarak ters faz preparatif HPLC ile saflaştırılabilir. Bu bölüm, tek zincirli sekansa özgü amfifilik 36 me peptidinden tabakalar oluşturma protokolünü açıklamaktadır.

Peptit zinciri sentezlendikten, saflaştırıldıktan ve liyofilize edildikten sonra, elde edilen beyaz toz, 2 milimolar stok çözelti hazırlamak için DMSO içinde çözülür. Ardından, 20 mikromolar peptit çözeltisi hazırlamak için bir Dr.Glass dosyası temin edin. İlk olarak, 445 mikrolitre milli Q su ve 50 mikrolitre 10 x sheet formation buffer ekleyin.

Karıştırmak için flakonu vorteksleyin. Ardından, iki millimolar peptide stok çözeltisinden beş microliters ekleyin ve hafifçe şişirin. Oluşan çözelti tabakaları, seyreltilmiş sulu peptide çözeltisinin hafifçe çalkalanmasıyla meydana gelir.

Kapağı kapalı cam şişe, yatay konumdan dikey konuma doğru yavaşça eğilir. Bu işlem tabakalar oluşmasını sağlar; hafifçe sallamak da aynı şekilde tabakalar üretir. Ancak, yüksek kaliteli birçok tabaka için, sallama yöntemiyle elde edilenlerin daha küçük olma ve daha az düz kenara sahip olma eğiliminde olduğu görülür.

Nano sayfaların floresan boyanması için cam şişeleri bir tüp rotatörü veya özel bir sallayıcı kullanarak bir gün boyunca yatay eksende yavaşça döndürün; 1 µM final konsantrasyon elde etmek için 100 µL nano sayfa çözeltisine 100 µM'lık Nile red'den 1 µL ekleyin. Nile red, hidrofobik ortamlarda lokalize olduğunda floresans yoğunluğu artan, çevreye duyarlı bir boyadır. Ardından, sıcak suda %1'lik bir agaroz çözeltisi hazırlayın ve plastik bir Petri kabına dökün.

Aros çözeltisinin yaklaşık bir sekizde bir inç kalınlığında olduğundan emin olun ve çözeltinin düz bir yüzey üzerinde, rahatsız edilmeden soğumasını bekleyin. Aros donduktan sonra, bir spatula kullanarak bir santimetreye bir santimetrelik kareler kesin. Ardından, kesilen kareleri aynı düzlemde toplamak için bir lam üzerine aktarın ve aros parçasının üzerine bir mikrolitre çözelti damlatın.

İki dakika sonra, aroslar tampon çözeltiyi emmeli ve tabakalar yüzeyde kalmalıdır. Tabakanın görüntülemesini 15 dakika içinde gerçekleştirin. Alternatif olarak, tabakaları ve çözeltiyi görüntülemek için bir cam lam üzerindeki 20 mm çaplı 0,12 mm'lik contanın içine 15 µL yükleyin.

Örneklemi bir lamel ile örtün ve nano tabakaların SEM görüntülemesini gerçekleştirmek için birkaç gün içinde görüntüleme yapın. Öncelikle, nano tabakaların tutunmasını kolaylaştırmak için silikon çipleri plazma ile aşındırın. Ardından, plazma işleminden geçmiş silikon substrat üzerine 20 µL peptit tabaka çözeltisi damlatın ve çözeltinin üç dakika boyunca beklemesini sağlayın; fazla çözeltiyi bir Kim wipe ucuyla alın, yüzeye 20 µL su damlatın ve tampon çözeltiyi ve tuzları uzaklaştırmak için fazla sıvıyı tekrar emdirerek temizleyin.

Alternatif olarak, tampon ve tuzu uzaklaştırmak için peptid tabaka çözeltileri suya karşı diyalize edilir. Bu durumda, diyalize edilmiş tabaka çözeltisinden 20 µL, plazma işleminden geçirilmiş silikon alt tabakalara damlatılabilir ve havada kurumaya bırakılabilir. Tabaka çözeltisi plazma işleminden geçirilmiş silikon alt tabakalar üzerinde kuruduktan sonra, tabaka, 1 kV ile 5 kV arasındaki demet enerjilerinde lens içi bir detektör kullanılarak SEM ile görüntülenebilir.

Yüksek derecede düzenli iki boyutlu bir nano tabaka şeklinde katlanan, diziye özgü 36 me blok yüklü bir peptidin sentezi, karakterizasyonu ve saflaştırılması gerçekleştirilmiştir. 36 me blok yüklü peptidin sentezinde kullanılan aminler; etilen diamini, fenetil amini ve t bütil beta alanini kapsamaktadır. Sentezin ardından, ham peptid %95 sulu TFA ile reçineden ayrılmıştır.

TFA çözeltisi toplandıktan ve buharlaştırıldıktan sonra, ham 36 me blok yüklü peptit ters faz HPLC ile saflaştırıldı. Saflaştırılmış blok yüklü peptidin kütlesi daha sonra MALDI ile doğrulandı.

Gözlemlenen 4981.2 kütlesi, hesaplanan 4981.74 kütlesi ile yakından örtüşmektedir. Liyofilize toz, iki millimolar stok çözelti hazırlamak için DMSO içerisinde çözülmüş ve dört degrees Celsius'ta saklanmıştır. Lamlar yukarıda belirtilen protokol ile hazırlanmış ve floresan optik mikroskobu ile görüntülenmiştir.

Özellik boyutları 300 mikrona kadar ulaşan çeşitli şekiller gözlemlenmiş olup, özellikle düz kenarlar belirgindir. Tabakaların görüntülenmesi için SEM de kullanılmış ve benzer şekilde belirgin düz kenarlar ortaya çıkarılmıştır. Bu video, peptidlerin katı faz sentezi ve peptidlerin sulu ortamda nano tabakalar halinde kendi kendine düzenlenmesi için basit ve verimli bir protokolü açıklamaktadır.

Kelimenin tam anlamıyla yüzlerce amino asit yapı taşı kolayca temin edilebildiği ve bu protokolde kullanılabildiği için, polipeptitlerle erişilebilen tasarım alanı pratik olarak sınırsızdır. Peptitler; sentetik esneklikleri, dayanıklılıkları ve düzenlenebilir yapıları nedeniyle biyomedisin ve nanobilim araştırmaları için gelecek vadeden malzemelerdir. Özellikle atomik düzeyde, nano tabakalar iki boyutlu görüntüleme iskeleleri, membran mimetikleri, biyolojik sensörler, protein mimetikleri ve cihaz üretimi için potansiyel bir platform görevi görür.

Trior, asetik asit ve bromo asetik asit gibi korozif reaktiflerle çalışmak son derece tehlikelidir; yaralanmaları önlemek için tüm reaksiyonları bir çeker ocakta gerçekleştirin ve uygun kişisel koruyucu donanım kullanın.