Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri

Bu video, Lipic B hücreleri kullanılarak saflaştırılmış membran proteinlerinin yüksek verimli kristalleştirme denemelerini kurma yöntemini gösterecektir. İlk olarak, bir lipid ve bir deterjan karıştırılarak B hücreleri hazırlanır; saflaştırılmış membran proteini B hücresi karışımına dahil edilir ve nanolitre robotu görsel incelemesi kullanılarak kristalleştirme denemeleri gerçekleştirilir. Standart bir ışık mikroskobu kullanmak, kristallerin varlığını ortaya çıkarır.

Protein kristalleri oluştuktan sonra, veri toplama ve yapı tayini için çıkarılabilir ve dondurulabilir. Bu tekniğin temel avantajı, B hücrelerinin benzersiz faz davranışı sayesinde, kristalizasyon için laboratuvarda bulunan standart ekipman ve robotik sistemlerin kullanılabilmesidir. B hücrelerini kurmak oldukça basit bir tekniktir ve hedef membran proteinini deterjan miselinden çıkarıp lipid bir ortama yerleştirmenize olanak tanır.

Bu, tarama yapabilmeniz için tamamen yeni bir koşul seti sağlar. Birçok membran proteininde başarıyla uygulanmış olan bu yöntem o kadar basittir ki, denememek için hiçbir neden yoktur. B hücresi tabanlı kristalleştirmenin ilk adımı, B hücresi oluşturacak bir lipid amfi karışımının hazırlanmasıdır.

Bu işlem önemli ölçüde çaba gerektirir ve en çok zaman alan aşamadır. Tamamlanmasının birkaç saat sürebileceğini unutmayın. B hücreleri, çeşitli lipid amfi kombinasyonlarında ve geniş bir konsantrasyon aralığında oluşabilir.

Önerilen başlangıç noktaları için ekteki yazılı protokoldeki birinci tabloya bakınız; 2,8'e 1 molar oranında bir mililitre %35 DMPC Chapo karışımı hazırlayarak başlayın. Bunu yapmak için, bir tüp içerisinde 0,26 gram DMPC ve 0,09 gram Chapo tartın. Deiyonize su kullanarak hacmi 1,0 mililitreye tamamlayın ve karışımı vorteksleyin.

Ardından, karışımı bir su banyosunda jel kıvamına gelene kadar yaklaşık 40 °C'ye ısıtın. Tüpü buza yerleştirin. Numune tekrar akışkan hale gelmelidir.

Ardından birkaç dakika daha vorteksleyin; lipid tamamen çözünene kadar ısıtma, soğutma ve vorteksleme adımlarını tekrarlamaya devam edin. Döngü sayısı arttıkça, işlem sonunda soğutma sırasında karışım bulanıklaşabilir. Karışım, oda sıcaklığında veya üzerinde berrak bir jel, buz üzerinde ise viskoz bir sıvı olacaktır; hücreler uzun süreli saklama için -20 °C'de tutulabilir.

Ardından, saflaştırılmış proteinler B hücre ortamına dahil edilir. Bu basit bir işlemdir ve videonun bir sonraki bölümünde gösterilen kristalizasyonla aynı gün gerçekleştirilmelidir. DMPC capso B hücre karışımını, faz berrak bir jele dönüşene kadar oda sıcaklığında çözün.

Karışımı sıvılaştırmak için buza yerleştirin ve ardından homojen bir B hücresi fazını yeniden oluşturmak için kısa süreliğine vorteksleyin. Bu noktadan itibaren, B hücresi karışımını ve saflaştırılmış proteini buz üzerinde tutun. Bu, B hücresini sıvı fazda tutarak pipetle alınabilir hale getirecektir.

Ardından, B hücresi karışımını, saflaştırılmış deterjanla çözünür hale getirilmiş proteine hacimce birle dörde oranında ekleyin. Daha sonra, çözelti berrak ve homojen hale gelene kadar nazikçe pipetle yukarı ve aşağı çekerek karıştırın. Kabarcıklar oluşursa, masaüstü santrifüjde kısa süreliğine çöktürün.

Proteinin hücreler tarafından tamamen bünyesine katılımını desteklemek için karışımı buz üzerinde en az 30 dakika inkübe edin. Protein-hücre karışımı artık kristalizasyon denemeleri için hazırdır. Kristalizasyon denemeleri, bir mosquito kristalizasyon robotu kullanılarak gösterilecektir.

V tabanlı 96 kuyucuklu bir plakayı buz üzerine yerleştirerek soğutun. Çözeltinin viskozitesinin minimum düzeyde olduğundan emin olmak için protein ve hücre karışımını plakaya pipetleyin. Protein ve hücre karışımını son adıma kadar buz üzerinde tutun.

Burada kullanılan robot beş platforma sahiptir. Rezervuarı içeren mikroplakayı üçüncü platforma ve damlaların dağıtılacağı kristalizasyon kapağını beşinci platforma yerleştirin. Ardından, hücre bazlı protein plağını dağıtım konumuna en yakın olan dördüncü platforma yerleştirin.

Bu, protein ve hücre karışımının robot tarafından en son alınmasını ve hemen ardından bırakılmasını sağlar. Yazılımı kullanarak çalışmayı başlatın; robot önce rezervuar çözeltisini, ardından protein ve hücre karışımını alacak ve dağıtım sırasında ısınmayı ve viskozite artışını önlemek için bunları kapağın üzerine damlalar halinde bırakacaktır. Çalışma tamamlanır tamamlanmaz, mosquito cihazını rezervuar ile protein ve hücre karışımını karıştıracak şekilde programlamayın.

Hücre protein plakalarını cihazdan çıkarın ve buz üzerine yerleştirin. Cihazın kapağını çıkarın ve damlalar ters gelecek şekilde rezervuar çözeltisini içeren plakanın üzerine yerleştirin. Plakayı 20 °C'de inkübe edin.

Kristal oluşumu ve optimizasyonu için diğer sıcaklıkların da test edilebileceği unutulmamalıdır. Daha yüksek sıcaklıklar, proteini katmanlar halinde önceden organize etme avantajına sahip olan lameller fazı indükler. 4 °C ile 20 °C arasındaki sıcaklıklar taranabilir.

Dört santigrat derecenin altındaki sıcaklıklar, lipidlerin uzun süreler boyunca çökmesine neden olabilir; birinci, üçüncü gün ve sonrasında haftalık olarak, standart bir ışık mikroskobu kullanarak kristal görünümünü ve büyümesini değerlendirin. Burada, sadece saldırı koşulunda gözlemlenen iğne şeklinde kristallerin bir aydınlık alan görüntüsü ve bir UV görüntüsü gösterilmektedir. Kristallerden floresans tespit edilmemiştir, bu da bu görüntüde yalancı pozitif olduğunu göstermektedir.

Çökeltici olarak metil propan diol kullanıldığında oluşan çubuk şeklinde bir kristal. Kristal, protein kristali olabileceğine işaret eden zayıf bir floresan göstermiştir ancak X-ışını kırınımı ile protein olmadığı belirlenmiştir. Burada, denemeler kurulduktan yaklaşık dört hafta sonra gözlemlenen bir kristal gösterilmektedir.

UV ışığı altındaki güçlü floresan, bunun bir protein kristali olduğunu doğrular. Bu videoda izlediğiniz üzere, B hücreleri hazır olduğunda, saflaştırılmış protein ile doğrudan karıştırılabilirler ve bu noktadan itibaren kristalleşme süreci, standart deterjan tabanlı protokollerle neredeyse tamamen aynı şekilde ilerler.

Bir diğer belirgin avantaj, optimizasyon amacıyla B hücrelerini belirli lipidlerle katkılamış (dope etmiş) olma imkanıdır. Bu tekniğin gerçekten çok yönlü bir yapısı vardır ve kullanımı o kadar basittir ki tüm membran proteini kristalizasyon projelerinde denenmelidir.