Elektron Kristalografi Yapısal Biyoloji Araştırmaları Küçük Membran Proteinleri İki boyutlu Kristalizasyon Denemeler değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, elektron kristalografisi ile membran proteinlerinin yapısal tayini için en uygun 2D kristalizasyon koşullarını belirlemektir. Bu işlem, öncelikle saflaştırma sırasında proteini doğal lipid çift tabakasından çözünebilir hale getirmek için uyumlu bir deterjan kullanılarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, protein-lipid-deterjan karışımının diyalizi yoluyla ekzojen lipid eklemek ve deterjanı uzaklaştırmaktır; bu işlem dikkatle kontrol edilen koşullar altında 2D kristallerin oluşmasıyla sonuçlanır.

Prosedürün üçüncü adımı, örnekleri şok dondurarak camsı bir duruma getirmektir. Prosedürün son adımı ise cryo EM ile veri toplamaktır. Nihayetinde, verilerin hesaplamalı görüntü işleme yöntemleriyle analiz edilmesi sonucunda proteinin nihai yapısını ortaya koyan sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben laboratuvardanım. Georgia Institute of Technology Biyoloji Okulu'ndayım. Merhaba, ben Tina dreaded.

Ben Georgia Teknoloji Enstitüsü Kimya ve Biyokimya okulundaki Berry Lab'den ve Biyoloji okulundaki Schmidt Kray Lab'den geliyorum. Ben de Georgia Teknoloji Enstitüsü Biyoloji okulundaki Ingleborg Schmidt Cry laboratuvarından Matt Johnson. Bugün size EM ile 2D koralasyon denemelerini değerlendirmek için bir prosedür göstereceğiz.

Laboratuvarımızda 2D kristalizasyon koşullarını belirlemek ve optimize etmek için bu protokolü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, karbon kaplı 400 mesh bakır transmisyon elektron mikroskobu veya TEM ızgaraları üzerinde negatif boyanmış numuneler hazırlanır. Karbon kaplı bir TEM ızgarasının altına iki µL protea lipozom numunesi pipetleyin ve 60 saniye boyunca inkübe edin.

Numune eşit şekilde dağılmazsa, pipet ucunun yanıyla nazikçe yayın. Ardından, kenarı yırtılmış bir parça watman 4 numara filtre kağıdı ile engelleyin. Bu işlem, protea lipozomlarının aşırı kaybı olmadan sıvının optimal şekilde uzaklaştırılmasını sağlar ve hassas karbon filmin korunmasına yardımcı olur.

Blotlama işleminin hemen ardından, 30 saniye sonra 2 µL %1'lik uranylsasetat boyası uygulayın ve ızgaranın kenarından blotlayın. Örneği yüksek konsantrasyonlarda, tipik olarak %10 ila %20 aralığında viskoz gliserol veya sakkaroz içeriyorsa, negatif boyama öncesinde ızgaranın gliserol veya sakkaroz içermeyen bir tamponla birkaç kez yıkanması, uranylsasetat çözeltisi ile uygun boyamanın gerçekleşmesine yardımcı olabilir.

Izgaralar hazırlandıktan sonra, membran oluşumunun dağılımını ve morfolojisini değerlendirmek ve genel ızgara kalitesini belirlemek amacıyla düşük büyütmede numuneyi görselleştirmek için elektron mikroskobu kullanılır. Ardından, görüntüler elde etmek ve 2D kristalleri tanımlamak için görüntülerin RIA dönüşümlerini gerçekleştirmek üzere yüksek büyütme kullanılır. Elektron mikroskobu numune tutucuya yerleştirilen ızgarada, ortalama membran dağılımı hakkında ilk izlenimi edinmek için 2000 ile 10,000 x arasında orta düzey bir büyütme kullanın.

Membranların dağılım düzeyini, morfolojilerini ve boyutlarını bir laboratuvar defterine not edin. Temsili görüntüleri bir CCD kamera ile kaydedin. Ardından, gerekirse, gridlerin genel bir görünümünü elde etmek için örnekleri yaklaşık 400 ila 800 x aralığındaki düşük büyütmelerle inceleyin.

Bu işlem; örnek konsantrasyonu, düzensiz protein ve lipozom dağılımı ile karbon filmin kısmen yırtılması gibi sorunları ortaya çıkararak grid hazırlığını değerlendirmek için değerli bilgiler sağlayabilir. Düşük veya orta büyütmede ilgilenilen bir grid alanını belirleyin. Ardından, farklı membranlardaki olası düzeni değerlendirmek için yüksek büyütme kullanın.

Bu durum, 2D kristalizasyon denemelerinin erken aşamalarında kritik öneme sahiptir. İyi düzenlenmiş alanlara sahip gelecek vaat eden protein lipozomlarını belirlemek ve sonraki deneyler sırasında tekrarlanabilirliği doğrulamak amacıyla, 2D kristalleri taramak için en uygun yüksek büyütme ayarını belirlemek üzere 50,000 ile 60,000 x arasındaki bir büyütme ile başlayın. 2D kristal boyutlarına ve birim hücre boyutuna bağlı olarak, yüksek büyütme ayarı 30,000'e kadar düşürülebilir veya 80,000'e kadar yükseltilebilir.

Burada, görüntünün ilgi alanına bitişik bir konumda, ilgi alanının gerçekten bir membran olup olmadığı konusunda belirsizlik varsa yaklaşık eksi 400 nanometre veya daha fazla odak dışı bırakma (defocus) uygularız. Örneği, proteolipozomlarla karıştırılabilecek karbon film parçaları, MICA veya diğer artefaktlar açısından inceleyin. Ayrıca, tipik membran katlanmasını ve morfolojisini ayırt etmek için kenarları gözlemleyin.

Ardından, ilgi alanını bir CCD kamera ile inceleyin. Optimal yüksek büyütme ayarında bir CCD görüntüsü toplandığında, daha küçük ve/veya çoğunlukla hidrofobik bir membran proteininin örgüsü, CCD görüntüsünün görsel değerlendirmesiyle fark edilemeyebilir. Bu durumda, görüntünün tamamı çevrimiçi bir Fourier dönüşümü veya FT için kullanılır.

Ancak, sıralı dizi küçükse, bu FT önemli miktarda gürültü içerecektir; sinyal-gürültü oranını artırmak için kutulu görüntü boyutunu küçültün, küçültülmüş kutuyu görüntü üzerinde hareket ettirin ve canlı bir FT gerçekleştirin, sıralı dizilerin optimal tanımlanması için canlı FT'nin gama fonksiyonunu ayarlayın. Aşırı yüksek bir gama değeri, gürültü katkıları nedeniyle lekeleri gizleyebilirken, aşırı düşük bir değer daha zayıf lekelerin tanımlanmasını engelleyecektir; negatif boyamalı 2D kristallerin çözünürlüğünün, minus 400 nanometers'lik bir DFO'da yaklaşık 15 angstroms olması beklenir.

Bir ila üç sıra nokta tespit etmeniz beklenir. Noktaların keskinliğine ve herhangi bir mozaik yapıya dikkat edin. Küçük, 18 kilodaltonluk bir membran proteininin 2D kristalleri birkaç mikron büyüklüğe kadar ulaşabilir.

FTS üzerindeki lekelerin keskinliği ve canlı FT kutusundaki hareketin kolayca tanımlanabilmesi, kristal örgü yapısının mozaikleşme olmadan sürekli olduğunu gösterir. Daha geniş bir çözünür domaine sahip daha büyük bir proteinin örgü yapısı T-E-M-C-C-D görüntü toplama sisteminin küçük ekranında tanımlanabilir; ancak düzensiz bir proteinin FT'sindeki mozaik gürültüsü gibi özellikler dahil olmak üzere, örgü kalitesinin daha iyi bir değerlendirmesini yapmak için FT gereklidir. Lekelerin küçük protein 2D kristallerinden mi yoksa gürültüden mi kaynaklandığını belirlemek için lipozomlar zayıf lekelerle karıştırılabilir.

Canlı ft için kutuyu hareket ettirin. Benekler anında kayboluyorsa bunlar gürültüdür; ancak küçük bir alanda bile değişmeden kalıyorlarsa, lipid kristalleri belirgin bir morfoloji ve ft sergilediği için muhtemelen kristaller mevcuttur. Bu lipid kristalleri, bir görüntünün görsel incelemesi ve tutarlı birim hücre boyutları ile de tanınabilir.

İlk denemelerde çökelme meydana gelebilir. Protein çökelmesi ile lipid agregatlarını birbirinden ayırmak için yüksek büyütmeli inceleme kullanılır. Lipid agregatlarının oluştuğu durumda, rekonstitüsyon aslında gerçekleşmiş olabilir ve sonraki deneyler, 30,000 ile 50,000 x'te rekonstitüsyonu indüklemek yerine, yalnızca membran boyutunu artırmak ve düzen oluşturmak için gerekli parametrelerin ayarlanmasını gerektirecektir.

Bu koyu yapıların kenarları, bunların protein içermeyen membranlardan oluştuğunu ortaya koymaktadır. Optimal koşullar altındaki çöktürme örnekleri, yüksek oranda 2D kristal içerecektir. Veri toplama işlemi için en büyük ve en düzenli 2D kristaller görsel olarak seçildiğinden, membranların homojen bir görünüme sahip olması gerekmemektedir.

Bu tür örnekler, kriyojenik EM veri toplama sürecinde maksimum sayıda yüksek çözünürlüklü görüntü elde etmek amacıyla kullanıldıklarında, kristalleşme gerçekleştiğinde kolayca tanınacaktır. Bu prosedürü uygularken, TEM ile küçük membran proteinlerinin 2D kristallerinin nasıl taranacağını göstereceğiz. Bu noktaya kadar önemli miktarda zaman ve emek harcamış olduğunuz için, gelecek vaat eden bir kristalleşme koşulunu gözden kaçırmamak adına titiz davranmanız gerektiğini unutmamak önemlidir.

Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.