Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

Merhaba, Membran Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji Grubu'na hoş geldiniz. Benim adım Martin Caffery. Araştırmamızın odak noktası, şeması ilk slaytta gösterilen biyolojik membrandır; hücreyi ve varsa hücre altı organelleri çevreleyen membran, yalnızca iki lipid molekülü kalınlığında olan ve proteinlerle bezenmiş moleküler düzeyde ince bir yapıdır.

Hem lipidler hem de proteinler için uygulanan yapı ve fonksiyonlarla ilgileniyoruz. Ancak, bu JO serisinin amaçları doğrultusunda, odağımı membran proteinleri ile sınırlandıracağım. Bu membran proteinlerinin moleküler düzeyde nasıl çalıştığını iki nedenden dolayı anlamaya çalışıyoruz.

Birincisi, bir şeyin nasıl çalıştığını bilmenin verdiği entelektüel tatmin vardır. İkincisi, tıpkı bisikletiniz veya arabanızda olduğu gibi, nasıl çalıştığını bilmek, arızalandığında onu onarma olasılığını beraberinde getirir. İlaç tasarımı, bu tür çalışmaların açık bir sonucudur.

Bir membran proteininin moleküler düzeyde nasıl çalıştığını anlamak için izlediğimiz yaklaşım, proteinin kristalografik yapısını belirlemektir. Bu işlem, proteini oluşturan tüm atomların veya en azından hidrojen dışındaki tüm atomların üç boyutlu uzaydaki konumlarının saptanmasını içerir. Bu amaçla kullandığımız yönteme makromoleküler X-ışını kristalografisi veya kısaca MX denir.

Burada, yapısı MX kullanılarak belirlenmiş bir membran proteini örneği görüyoruz; MX yapabilmek için proteinin fraksiyon kalitesinde bir kristali gereklidir. Tahmin edebileceğiniz gibi, burada gösterildiği üzere makromoleküler kristalografi kullanılarak yapı belirlemede birçok adım yer almaktadır. Bunlar tipik olarak, bir membran proteini hedefinin belirlenmesini ve ardından bu proteinin üretilmesini, saflaştırılmasını ve kristalleştirilmesini içerir.

Difraksiyon ölçümleri, kristal üzerinde ev tipi veya senkrotron bir x-ışını kaynağı kullanılarak gerçekleştirilir. Difraksiyon verileri işlenerek bir elektron yoğunluk haritası elde edilir ve ardından bu haritaya bir moleküler model uydurulur. Rafine edilen model, proteinin etki mekanizmasının araştırılmasında ve yapı tabanlı ilaç tasarımında kullanılabilir.

Bu JoVE makalesinin amacı, lipid mezo fazlar kullanılarak sözde "in meso" yöntemi ile membran proteinlerinin nasıl yüksek kaliteli kristallerini ürettiğimizi göstermektir. Yönteme ve kapsamına ilişkin güncel bir derleme referans birde mevcuttur. Burada takip edeceğimiz adım adım protokol referans ikide açıklanmıştır; bir in meso membran proteini kristalleştirme denemesinin kurulması için gereken adımları ve süreyi özetleyen akış şeması ise burada gösterilmektedir.

Bu video, kırmızı kesikli çizgilerle çevrelenmiş olan adımları kapsamaktadır. Manuel modda mezo kristalizasyon yapmak için ihtiyacınız olacak ögeler burada gösterilmiştir. Bunlar arasında, konak mezyi oluşturmak için saflaştırılmış membran proteini lipidinin konsantre bir çözeltisi bulunur; lipidi daha belirgin hale getirmek için genellikle mono ole kullanılır.

Bu videoda; kırmızı boya çöktürücü çözeltiler, saflaştırılmış su boru petting cihazları ve tek kullanımlık uçlar, bazıları çıkarılabilir iğneli olan çeşitli sızdırmaz Hamilton şırıngaları, protein çözeltisini lipid ile karıştırarak mease üretmek için kullanılan dar lümenli bir kuplör, Hamilton marka tekrarlayıcı dispenser, cam mikroskop lamları ve lamel cover slip'ler, kuyu oluşturmak için ideal olarak silanize edilmiş delikli çift taraflı yapışkan ara bant, cımbız, kırık buz, dokular, bir hesap makinesi ve hepsinden önemlisi laboratuvar defteriniz kullanılmıştır.

Aşağıdaki prosedür, cam sandviç kristalizasyon plakası hazırlamak için kullanılır. Yükleme için, silanlanmış bir mikroskop lamını tezgaha yerleştirin. Delikli çift taraflı ara bant şeridinin bir yüzeyindeki koruyucu kağıt kapağı çıkarın.

Bandın yapışkan yüzeyi lam yüzeyine gelecek şekilde yerleştirin ve üzerine baskı uygulayın. Bandı lama sabitleyin. Kuyucukların tabanını korumak için bant ile rulo arasına alüminyum folyo yerleştirilerek bir brayer veya rulo kullanılabilir.

Üstteki yapışkan yüzeyi açığa çıkarmak için ikinci kağıt kapağı banttan ayırın. Bu işlem, yüklemeye hazır bir cam plaka oluşturur ve yükleme tamamlanır tamamlanmaz mühürleme yapılabilir. Kuyucukların hızlı ve verimli bir şekilde mühürlenmesi için, tekli silolanmış lamelleri plakanın yakınına yerleştirin.

Lipidi eritmek için sıcaklık kontrollü bir blokta 45 °C'de üç dakika bekletin. Kullanılan lipidin tipik olarak mono land olduğunu unutmayın. Bu videoda, lipid erirken görünürlüğü artırmak için lipide kırmızı bir boya eklenmiştir.

Lipid protein karıştırma adımında kullanılmak üzere iki adet 100 µL gaz sızdırmaz Hamilton şırıngası hazırlayın; protein solüsyonunu içerecek olan şırıngadaki Teflon yağını temizleyin. Lipid içeren şırıngayı bunun yanına yerleştirin. Bu durumda, yağ olduğu gibi bırakılır.

Dar lümenli kuplörü iki şırınganın arasına yerleştirin ve ardından kuplörü lipid şırıngasının ucuna bağlayın. Kuplörü şırıngaya sıkıca sabitleyin ancak aşırı sıkmaktan kaçının. Pistonu lipid şırıngasının gövdesinden çıkarın.

Lipidin erimiş olduğundan emin olun. Pipeti 30 µL değerine ayarlayın ve erimiş lipid kapağından yavaşça 30 µL alın. Lipid flakonu.

Lipid, azot veya argon altında -80 °C'de saklanmalıdır. Erimiş lipidin mümkün olan en fazla miktarı, şırınganın açık ucundan yavaşça aktarılmalıdır. Bu sırada hava boşluğu oluşmamasına dikkat edilmelidir.

Şırıngayı dikey tutarak pistonu, erimiş lipid ile temas edecek şekilde gövdeye yerleştirin ve pistonu gövde boyunca yavaşça ilerletin. Gösterildiği gibi, işlem sırasında yanlışlıkla hapsolmuş hava kabarcığı yukarı çıkar ve tahliye edilir. Artık gövdede, hacmini kesin olarak belirlemeniz gereken bir erimiş lipid tıkaç bulunmaktadır.

Bu işlem, şırınga gövdesi üzerindeki işaretler okunarak yapılabilir. Bu durumda hacim 23 microliters'tır ve bu değer laboratuvar defterine kaydedilir. Kılıfı, konnektörden uzanan iğnenin üzerine kaydırın.

Erimiş lipidi namlu boyunca yukarı itmek ve ardından yavaşça ve nazikçe konnektörün merkezindeki iğneye aktarmak için pistonu kullanın. İğne hafifçe fazla doldurulursa, lipidin açık uçtan dışarı çıktığı görülecektir. Pistonu hafifçe geri çekerek, fazla lipid konnektör iğnesinin ucuyla tam olarak aynı hizaya gelene kadar konnektöre geri çekilebilir.

Bu durumda, şırınga bağlayıcı ünitesi tamamen doldurulmuş ve protein şırıngası ile birleştirilmeye hazır hale getirilmiştir. Büyük agregatları uzaklaştırmak için çözelti, 14, 000 G'de 10 dakika boyunca, dört santigrat derecede beş ila 10 dakika santrifüjlenmelidir. Kristalizasyon deneylerini kurmadan önce, protein çözeltisini buz kovasından çıkarın ve oda sıcaklığında dengeye gelmesini sağlayın.

20 °C sıcaklıkta, olean için tam hidratasyona veya buna yakın bir seviyeye sahip kübik fazı oluşturmak amacıyla kullanılacak protein çözeltisinin hacmini hesaplayın. Faz diyagramında olduğu gibi, su ile tam hidratasyon ağırlıkça yaklaşık %40 su oranında gerçekleşir. Lipid şırıngasının, 0,94 mg/µL yoğunlukta 23 µL mono ile doldurulduğunu hatırlayın.

Bu, 21,6 miligram lipide karşılık gelmektedir; dolayısıyla 21,6 çarpı dört bölü altı, yani 14,4 miligram veya 14,4 mikrolitre protein çözeltisi gereklidir. 25 veya 50 mikrolitrelik bir Hamilton şırıngası ile gerekli protein çözeltisi hacmini çekin, çözeltiyi şırınga gövdesindeki pistonun Teflon ucuna aktarın. Hava kabarcıkları oluşmamasına dikkat ederek iğneyi dikkatlice geri çekin ve şırıngadaki protein çözeltisi hacmini ölçün. Bu değer, önceki adımda belirlenen değerle eşleşmelidir.

Lipid yüklü şırınga ile birleştirme hazırlığı için, protein solüsyonunu şırınga gövdesi boyunca dikkatlice yukarı doğru ilerleterek açık uçla aynı hizaya getirin. Bu işlem, şırınganın çıkış ucundan içeriye bakılarak gözlemlenebilir.

Lipin protein çözeltisi yüklü şırıngalar artık birleştirilmeye hazırdır; bunu yapmak için protein şırıngasını, lipid şırıngasına bağlı olan ara parçanın açık ucuna vidalayın. İki şırınga ara parça vasıtasıyla birleştirildiğinde, bir şırıngadaki lipidden ara parça üzerinden diğer şırıngadaki protein çözeltisine kadar kesintisiz bir sıvı hacmi oluşmalıdır.

Karıştırma hazırlığı aşamasında, birleştirilmiş ünite, bir şırınga sağ elde ve diğeri sol elde olacak şekilde tutulur. Bağlayıcıdaki olukların sızdırmazlığının sıkma işlemi sırasında bozulmamasını sağlamak için, her iki elin parmakları ve başparmakları kullanılarak her iki gövde üzerinden bağlayıcıya tork uygulanır. Bu aşamada hatalı birleştirilmiş karıştırma cihazı, ALS'ye zarar verecek ve sıkma işlemi sırasında sızıntıya yol açacaktır.

Bu durum, kaçınılmaz deneme yanılmalar ve zaman zaman numune kayıpları ile ilgili bir deneyim meselesidir. Bu nedenle, değerli protein çözeltilerini kullanmaya başlamadan önce sistemi tanımak adına lipid ve su veya tampon çözelti ile pratik yapmak faydalıdır; karıştırmayı gerçekleştirmek için montajlanmış karıştırma ünitesinin protein tarafındaki pistonu, başparmak veya işaret parmağıyla sonuna kadar ilerleterek protein çözeltisini protein şırıngasından dışarı, bağlayıcı üzerinden lipid şırıngasına doğru itin. Ünite etkili bir şekilde sızdırmaz hale getirildiyse, bu işlem lipid tarafındaki pistonun eşit ve zıt yönde hareket etmesini sağlayacaktır.

Lipid tarafındaki piston, lipid şırıngasının içeriğini tekrar kolon üzerinden protein şırıngasına itmek için kullanılır. Bu işlem birçok kez tekrarlanır. Homojen bir karışım fazı oluşturmak için bazen yüz veya daha fazla geçiş gerekebilir.

Karıştırma işleminin başlangıcında, materyalin bağlantı parçası (coupler) üzerinden ileri geri hareketi düzensiz olabilir ve karıştırmayı gerçekleştirmek için zaman zaman ekstra kuvvet gerekebilir. Bu durum beklenen bir durumdur. İlk karıştırma işlemine genellikle örnekte homojen olmayan bir bulanıklığın oluşması eşlik eder ve bu da yine beklenen bir durumdur.

Homojenizasyon ilerledikçe, pistonları ileri geri hareket ettirmek için gereken kuvvetle hissedilen doku ve ortaya çıkan kübik fazın görsel görünümü, viskoz kübik faza özgü olacak şekilde daha tekdüze hale gelir. Koşullar uygunsa ve kübik faz oluşursa, dispersiyon şırınga gövdesinde optik olarak şeffaf görünmelidir.

Bu nedenle, şırınga gövdesi üzerindeki işaretler, gövdedeki mezo faz üzerinden net bir şekilde okunabilmelidir. Renkli proteinlerin durumunda, mezo faz proteinin rengini alacaktır ancak optik olarak şeffaf kalacaktır. Şırınga karıştırıcının kısa bir süre buz üzerinde bekletilmesiyle karıştırma sırasında numunenin çok hafifçe soğutulması, homojenleşmeyi ve şeffaflığın sağlanmasını hızlandırabilir.

Ancak, örneği aşırı karıştırmamak önemlidir; sürtünme kaynaklı ısınma nedeniyle örnek sıcaklığının yükselmesine yol açabileceğinden, aşırı şiddetli karıştırmadan kaçınmaya özen gösterilmelidir. Bu aşamada, kübik mesa fazı oluşmuş ve protein lipid tabakasına yeniden yerleştirilmiştir. Mesa fazı artık kristalizasyon plakalarının münferit kuyucuklarına dağıtılmaya hazırdır.

Ancak öncelikle, mezo faz, tekrarlayıcı bir dağıtıcıya monte edilmiş 10 µL'lik bir Hamilton şırıngasına aktarılmalıdır. Bu işleme şırıngayı dağıtıcıya bağlayarak başlayın. Şırıngayı kübik mezo faz ile doldurun.

İğneyi ve pistonu şırıngadan çıkarın. Teflon vana yerinde kalsın. Sabitleme somununu küçük bir madeni para yardımıyla dağıtıcıdan çıkarın.

Sıralı kol tamamen geri çekilmiş durumdayken, pistonu ve iğnesi çıkarılmış olan şırıngayı dispenserin tutma halkasından geçirin. Tutucu somunu, conta tarafı şırınga boyunca bakacak şekilde yerleştirin ve şırınganın açık ucuna sıkıca vidalayın.

Şırınganın tutucu halkada düzgün şekilde ortalandığından ve gövdenin cırcır koluna paralel olarak hizalandığından emin olunmalıdır. Her iki durum da gözle kontrol edilebilir. Bu iki gereksinim önemlidir çünkü piston serbestçe hareket etmezse, yükleme sırasında kaynak şırıngasında basınç birikebilir ve sızıntı meydana gelebilir. Pistonu, birkaç tur gevşetilmiş tutucu somunla birlikte kavrayıcı halkadan geçirin ve pistonu şırınganın açık ucuna doğru yönlendirin.

Sıçratma koluna tamamen basarak pistonu gövdenin içine itin ve pistonun gövde içinde serbestçe ve tamamen hareket ettiğini kontrol edin. Eğer vida ve kılavuz çubuk gevşetilmişse, bunları yeniden sıkın ve pistonun serbestçe hareket ettiğini tekrar kontrol edin. Dağıtım şırıngası artık doldurmaya hazırdır.

Montajı tamamlanmış karıştırma ünitesinin bir tarafındaki pistonu sıfır mikrolitre mezuniyet çizgisine getirin. Mezo fazı diğer şırıngaya ve ara parçaya aktarmak için, boş şırıngayı UL'si yerindeyken karıştırma ünitesinden ayırın ve yüklü şırıngayı, ara parçasıyla birlikte derhal 10 mikrolitrelik dağıtıcı şırınganın dişli ucuna bağlayın.

Bağlantının ne kadar sıkı yapıldığı kritik bir öneme sahiptir. Daha önce belirtildiği gibi, mezo fazın kuplör üzerinden aktarılması için 100 mikrolitrelik şırınganın pistonu bastırılarak dağıtım şırıngası doldurulur. Eğer bağlantı sıkıysa ve dağıtım şırıngasındaki piston serbestçe hareket ediyorsa, dağıtım şırıngası dolarken pistonun, doldurma pistonunun hareket yönünde hareket etmeye başlaması gerekir.

Koppüler takılı olan doldurma şırıngasını, dağıtma şırıngasından ayırın. Dağıtma şırıngasının çelik ucuna kısa, düz uçlu bir iğne sabitleyin ve dikkatlice sıkıştırın. Kavrama halkasındaki düğümü sıkarak pistonu cırcır koluna sabitleyin.

Düğümün aşırı sıkılmamasına dikkat edilmelidir. Çünkü bu durum, pistonun çizilmesine ve deforme olmasına yol açarak onu kullanılamaz hale getirebilir. Sıkıştırılmış durumda cırcır koluna sağlanan hareket aralığının bir inçten fazla olmaması önemlidir.

Burada gösterildiği gibi, pistonun bükülme eğilimi olacaktır ve iletim başarısız olabilir. Pistonu namlu içinde ilerletmek, böylece iğnenin boş hacmini doldurmak ve iğneyi yüklemek için cırcırlı tambura birkaç kez basın. Bu adım, iğne ucundan sürekli bir mesa fazı şeridi çıkana kadar 10 kez tekrarlanmalıdır.

İğne artık, derhal başlatılması gereken kristalizasyon denemelerinin kurulmasında kullanılmaya hazırdır. Kristalizasyon denemeleri kurulmadan önce, protein yüklü kübik fazın çok uzun süre bekletilmesi önerilmez. Bazı proteinler, ek çöktürücü içermeyen kübik fazda kararsız olduğundan, yüklemeyi kolaylaştırmak için çok kuyucuklu bir kristalizasyon plakası ve lamelini tezgahın birkaç inç üzerinde yükseltilmiş bir yüzeye yerleştirin.

Yüzey hafif karanlık olduğunda optimal kontrast ve artırılmış görünürlük elde edilir. Çöktürücü çözeltileri homojenize edin ve şişelerin kapaklarını açın. Dispans şırıngasını bir elle dikey tutarken, çöktürücü dağıtım probunu bir mikrolitreye ayarlayın; boşta kalan elinizle iğne ucunu kuyucuğun tabanının merkezine ve doğrudan üzerine konumlandırın.

Bir numara. Cam yüzeye bir bolus mease püskürtmek için tekrarlayan dispenser üzerindeki düğmeye basın. Bolus hacmi 200 nanolitredir.

Standart tekrarlayıcı dispenser 10 µL'lik bir şırınga ile kullanıldığında, iğne ucu kuyucuk tabanının birkaç yüz µm üzerinden fazla olmamalıdır. Doğru dağıtımın sağlanması için tekrarlanabilir dağıtım kolaylıkla elde edilir; bunun için sadece biraz pratik yapmak yeterlidir. Ardışık dört kuyucuğa mease yüklendikten sonra, her bir mease bolusunun üzerine 1 µL çöktürücü çözelti yerleştirin.

Hasta başına iki mikrolitre kullanarak ve standart tek kullanımlık uçlarla mümkün olduğunca hızlı bir şekilde, dolu kuyucukların üzerine bir lamel yerleştirin; su sızdırmaz bir mühür oluşturmak için lamelin kuyucukları düzgün ve tekdüze bir şekilde kapattığından emin olun. Spacer bandın açıkta kalan yapışkan yüzeyiyle temas ettiği noktalarda lamele basınç uygulamak için bir spatula kullanın. Ölçüm ve çöktürücü dağıtma işlemi, plaktaki tüm kuyucuklar doldurulup mühürlenene kadar tekrarlanabilir.

Plaka artık inceleme ve inkübasyon için hazırdır. Takip amacıyla plakayı net bir şekilde etiketleyin. Işığa duyarlı proteinler, genellikle plakaların inkübasyon odasına yerleştirilmeden önce alüminyum folyo ile sarılmasıyla işleme alınır.

Bunlar çıkarılabilir ve düşük yoğunluklu veya uygun renkte ışık altında mikroskopla incelenebilir. Plakaları genellikle 20 °C civarındaki sıcaklık kontrollü bir hazneye düzenli bir program dahilinde yerleştirin. 10 veya 20 kat büyütmeli polarize ışık mikroskobu kullanarak duvarlardaki kristal büyümesini inceleyin.

Amaç, yazarın laboratuvarında kullanılan takvim şu şekildedir: kurulum sonrası 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30. gün. Mease bolusunu dikkatlice inceleyin. 140 mikron kalınlığındaki örnek içinde odak derinliğini ayarlayın.

İnceleme hem normal ışık altında hem de çapraz polarizörler arasında yapılmalıdır; kübik fazda büyüyen renksiz membran proteini kristalleri normal ışıkla bakıldığında şu şekilde görünür. Polarize ışıkla bakıldığında meso fazda büyüyen renksiz membran proteini kristalleri şu şekilde veya şöyle görünür; normal ışıkla bakıldığında meso fazda büyüyen doğal renkli membran proteinleri ise şu şekilde veya şöyle görünür.

Yapı belirleme genel sürecindeki sonraki adımlar, kristallerin hasat edilmesi ve kriyosoğutulması ile bunlardan elde edilen x-ışını kırınımının kaydedilmesi ve işlenmesidir. Bu konular, bu serideki ayrı JoVE makalelerinde ele alınmaktadır.