Enzim Asetat Kinaz Asetat oluşturan Faaliyet Doğrudan Algılama

Bu deney, asetat kinazın asetat oluşturma aktivitesinin doğrudan ölçülmesini amaçlamaktadır. Enzimi, asetil fosfat ve DP substratları içeren bir reaksiyon karışımına ekleyerek reaksiyonu başlatın. Ardından, geri kalan asetil fosfatı asetil hidroksilata dönüştürmek için hidroksilamin hidroklorür ekleyin.

Asetil hidroksilatı, ölçülebilir renkli bir ferrik hidroksilat kompleksine dönüştürmek için geliştirme çözeltisi ekleyin. Reaksiyonda tüketilen asetil fosfat substrat miktarına dayalı spektrofotometrik sonuçlar, enzim kinetik parametrelerinin belirlenmesine olanak tanır. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre avantajı, ATP üretiminin ADP redüksiyonuna eşlenmesi yerine, doğrudan asetil fosfat tüketiminin ölçülmesine dayanmasıdır. Bu analiz ATP üretimine dayanmadığı için, ATP yerine inorganik fosfat üreten yeni bir asetat kinaz grubu için kullanılabilir. Altı ila sekiz noktalı bir standart eğri için, asetil fosfat stok çözeltisini 100 millimolar Tris içinde 300 µL son numune hacmine kadar seyreltin; ayrıca asetil fosfat içermeyen bir kontrol numunesi de ekleyin. Tüm numuneleri 37 °C'lik bir ısıtıcı blokta bir dakika boyunca dengeleyin.

Şimdi, 50 µL 2 M hidroksilamin hidroklorür ekleyin, üç kez çalkalayarak karıştırın ve 60 °C'lik ısıtıcı blokta beş dakika inkübe edin. Ardından 100 µL geliştirme çözeltisi ekleyip üç kez çalkalayarak karıştırın ve oda sıcaklığında renk gelişiminin gerçekleşmesi için en az bir dakika bekleyin. Örnekleri, spektrofotometre için plastik küvetler kullanarak santrifüjleyin.

Numuneleri 540 nanometre'de ölçün. Uygun veri analizi ve grafik çizim yazılımını kullanarak, 540 nanometre'deki absorbans ile asetil fosfat mikromol değerleri arasında bir standart eğri oluşturun. R kare değerini hesaplayın.

Reaksiyon karışımından 300 µL'lik alikotları mikro santrifüj tüplerine dağıtın. Enzim içermeyen bir kontrol reaksiyonu eklemeyi unutmayın; tüpleri 37 °C'de bir dakika boyunca dengeleyin. Birden fazla reaksiyon gerçekleştiriliyorsa, enzimi tüplere belirli zaman aralıklarıyla ekleyin ve her tübü derhal 37 °C'lik ısıtıcı bloğa geri yerleştirin.

Beş dakika sonra, 2 M hidroksilamin hidroklorürden 50 µL ekleyin, karıştırın ve 60 °C'de beş dakika inkübe edin. Ardından 100 µL geliştirme çözeltisi ekleyin, karıştırın ve renk gelişimi için oda sıcaklığında bekletin. Daha sonra örnekleri 18.000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin.

540 nanometrede absorbans ölçümüne geçiniz. Asetil fosfat miktarını, asetil fosfat standart eğrisi ile karşılaştırarak belirleyiniz. Kinetik parametrelerin belirlenmesi için veriler grafiğe dökülebilir ve McKayla Cementin denklemine uydurulabilir.

Bu analiz, asetat oluşumu yönündeki asetat kinaz aktivitesini ölçmek için asetil fosfat substratının tüketimini belirler. Enzimatik reaksiyon sırasında belirli bir sürenin ardından kalan asetil fosfat, asetil oksibata ve ardından 540 nanometrede ölçülebilen kırmızı renkli ferrik hidroksi asetat kompleksine dönüştürülür. 540 nanometredeki absorbansı mikromol asetil fosfata karşı grafiğe döken bu tipik standart eğrinin eğimi, mikromol asetil fosfat başına 1,2332 absorbans birimidir.

Elde edilen 0,99'luk r kare değeri, verilerin burada gösterildiği gibi doğrusal denklemle iyi uyumlu olduğunu göstermektedir. Bu analiz, çeşitli enzim preparasyonları için asetil fosfatın KM değerini belirlemek amacıyla kullanılabilir. Beş milimolar DP ile farklı asetil fosfat konsantrasyonlarında, metanol Sarina termofilikten saflaştırılmış rekombinant asetat kinaz, her bir substrat için standart McKayla cementin benzeri kinetikler izleyerek 0,27 ± 0,01 milimolar asetil fosfatlık bir görünür KM değeri oluşturmuştur.

Standart eşleşmiş assay'in aksine, bu doğrudan assay, TP dışındaki substratları kullanan asetat kinazların aktivitesini ölçebilir. Örneğin, pirofosfat üreten E. histolytica asetat kinazı tarafından asetil fosfatın kullanımında, reaksiyon karışımındaki DP yerine sodyum fosfat kullanılmıştır. Elde edilen eğri, 0,50 ± 0,006 millimolar asetil fosfat değerinde görünür bir KM değerine işaret etmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, tüketilen asetil fosfat miktarını belirleyerek asetat kinaz aktivitesini doğrudan nasıl ölçeceğiniz konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.

Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmedeki temel faktör, özellikle enzim ekleme ve karıştırma aşamalarında her adımda tutarlı olmaktır.