Nitrik Oksit ve hücreler arası Elektron Paramanyetik Rezonans Spektroskopisi ile süperoksit Radikal Anyon tespiti Spin Tuzakları kullanarak

Ben Frederick Dina, Ohio State Üniversitesi'nde farmakoloji doçentiyim. Bu gösterimde, EPR Spin Tuzaklama yöntemini kullanarak hücrelerden nitrik oksit ve süperoksit tespitini göstereceğiz.

Reaktif oksijen ve azot türlerinin çeşitli hastalıkların gelişiminde rol oynadığı öne sürülmektedir ve bu nedenle biyolojik sistemlerde tespit edilmeleri büyük önem taşımaktadır. Biyolojik sistemlerde reaktif türlerin tespiti için yalnızca birkaç güvenilir yöntem uygulanmıştır, ancak bunlar özgünlük ve hassasiyet açısından sınırlıdır. Bununla birlikte, spin yakalama, ROS'ların tanımlanması için yaygın olarak kullanılmaktadır ve radikalin, kalıcı bir spin adukti oluşturan bir nitro spin tuzağına veya metal komplekslerine katılma reaksiyonunu içerir; bu aduktlar elektron paramanyetik rezonans spektroskopisi veya EPR ile tespit edilebilir, çeşitli radikal aduktları, üretilen radikallerin tanımlanmasında kullanılabilecek karakteristik spektrumlar sergiler ve radikal üretiminin doğası ile kinetiği hakkında zengin bilgiler sağlayabilir.

Nitrik oksit sentaz, nitrik oksit üretmek için N-A-D-P-H kullanarak L-arginin'in L-sitrülin'e dönüşümünü katalize eder. Oksidatif stres koşulları altında, NOS, "uncoupling" (ayrışma) olarak adlandırılan bir süreçle nitrik oksit üretmekten süperoksit üretimine geçebilir; bu durumun hem proteinin oksidasyonundan veya nitrik oksit düzenlemesini etkileyen kofaktörden kaynaklandığına inanılmaktadır. Biyolojik sistemlerde nitrik oksit düzenlemesi, vazodilatasyon gibi faydalı fizyolojik işlevlerle sonuçlanan hücre sinyalleşmesinde kritik bir rol oynadığı için önemlidir, ancak aşırı üretimi genellikle inflamatuar durumlarla ilişkilendirilir. Bu nedenle, biyolojik sistemlerde nitrik oksit tespiti büyük önem taşımaktadır.

Biyolojik sistemlerdeki bir diğer önemli sinyal molekülü sınıfı, nitrik oksit gibi reaktif oksijen türleridir; düşük konsantrasyonlardaki reaktif oksijen türleri hücre fonksiyonlarının düzenlenmesinde, sinyal iletiminde ve bağışıklık yanıtında önemli bir rol oynarken, kontrolsüz konsantrasyonlar hücresel oksidatif hasara yol açarak oksidatif strese neden olabilir. Süperoksit radikal anyonu, en önemli reaktif oksijen türlerinden biridir ve biyolojik sistemlerde mevcut olduğu bilinen en güçlü oksitleyici türlerden bazıları olan süperoksit nitrit ve hidroksil radikali gibi türlerin temel öncüsüdür. Bu nedenle, biyolojik sistemlerde süperoksitin tespiti ve/veya sekestrasyonu önemlidir; çünkü süperoksit oluşumu, oksidatif patlamanın başlangıcından önceki ilk belirtiyi sinyalleştirir.

Bu protokol, yazılı prosedürde açıklandığı şekilde kültürlenmiş sığır aort endotel hücrelerini tripsinize eder. Hücreleri etiketlenmiş altı kuyucuklu bir plakaya aktarın ve inkübasyonun ardından 37 °C ve %5 CO2'de gece boyunca inkübe edin.

Altı kuyucuklu plakayı inkübatörden çıkarın ve birinci kuyucuktaki besiyerini aspire edin. Hücreleri bir mililitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) ile iki kez yıkayın. 0,8 miligram demir sülfatın kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içeren bir mililitre DPBS'ye eklenmesiyle 1,9 milimolar demir sülfat heptahidrat çözeltisi hazırlayın.

Kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içeren 500 µL DPBS'ye 2,7 mg amonyum MGD ekleyerek MGD çözeltisini hazırlayın. Taze hazırlanmış 1,9 mM demir sülfat heptahidratın 210 µL'sini ve bir yedi molarite oranını kullanarak taze hazırlanmış MGD'nin 210 µL'sini ekleyin ve oluşan süspansiyonu karıştırın. 4,6 µL kalsiyum iyonfor ekleyin ve çözeltiyi pipetle aşağı yukarı çekerek tekrar karıştırın.

Ardından örneği 37 °C'de 36 dakika boyunca inkübe edin. Çöken süpernatantı bir eppendorf tüpüne toplayın. EPR kazanım parametreleri olarak 34,27 gauss merkez alanı, altı gauss modülasyon genliği ve 9,8 GHz frekans girin.

Parametreler cihazdan cihaza ve deneysel koşullara göre değişiklik göstereceğinden, bu ekipmanda kullanılan diğer parametreler için lütfen metne bakınız. Süpernatantı parafinle sızdırmaz hale getirilmiş bir EPR düz hücreye aktarın ve EPR boşluğuna yerleştirin. Deney çalıştıktan sonra, 121 tarama ve tarama başına 10,4 saniye ayarlarıyla yaklaşık 21 dakika boyunca spektrumları kaydedin.

Arka plan gürültüsünü azaltmak için baz hattını düzeltmek ve 2D spektrumları entegre etmek amacıyla Bruker WIN EPR işleme yazılımını kullanın. Tarama süresinin ve tarama sayısının bir deneyden diğerine farklılık gösterebileceği unutulmamalıdır. Ayrıca, baz hattını düzeltme yöntemleri de bir yazılımdan diğerine farklılık gösterebilir.

Enos ayrıştırılmasına başlamak için, altı kuyucuklu plakadaki ikinci kuyucuğun besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri 1 mL DPBS ile iki kez yıkayın. Ardından, hazırlanan 0.5 mM Syn one çözeltisinden 100 µL ekleyin ve hacmi %10 FBS içeren DPBS ile 2 mL'ye tamamlayın; hücreleri 37 °C'de ve %5 CO2'de iki saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından.

Hücreleri iki kez DPBS ile yıkayın. Ardından taze hazırlanmış 210 µL 2,8 mM demir sülfat heptahidrat ve önceki prosedüre göre taze hazırlanmış 210 µL 19,6 mM MGD ekleyin. Sonrasında, 4,6 µL 1,9 mM kalsiyum iyonu dört ekleyin ve çözeltiyi tekrar karıştırın.

Daha önce olduğu gibi, hücreleri 37 °C'de 36 dakika boyunca inkübe edin. 36 dakika sonra, bir eppendorf tüpünde çöken süpernatantı toplayın ve bir EPR düz hücreye aktarın. Edinimin ardından, daha önceyle aynı edinme parametrelerini kullanarak EPR spektrumlarını kaydedin.

Bu Protokol başlamadan önce verileri aynı Şekilde işleyin. 1 molar DMPO stok çözeltisi ve 0.1 milimolar DTPA içeren PBS hazırlayın. Ardından, dört çarpı 12'lik 1 miligram/mL'lik bir çözelti hazırlayın.

DMSO içinde Myra State 13 asetat veya PMA kullanılarak; 1 mg/mL D glukoz ve 1 mg/mL albümin içeren bir eppendorf tüpünde, PMA stok çözeltisini PBS ile 10 µg/mL'ye seyrelterek bir mililitrelik alikotlar hazırlayın. 1,5 mL'lik bir eppendorf tüpünde pipetle yukarı-aşağı çekerek mililitre başına 5 ila 6 milyon PMN hücresi hazırlayın. Yaklaşık 1,6 × 10⁶ PMN hücresi, 10 mM DMPO ve 0,2 µg/mL PMA içeren, final hacmi 60 µL olan bir karışım hazırlayın.

Bu deneyde, Bruker ESP 300 X band spektrometresi kullanacağız. Çözeltiyi bir EPR düz hücreye aktarın, ardından düz hücreyi EPR boşluğuna yerleştirin. EPR veri toplama parametreleri olarak 3,486 goss merkez alan, 0,5 goss modülasyon genliği ve 9.8 gigahertz frekans değerlerini girin.

Parametreler bir cihazdan diğerine ve deney koşullarına göre farklılık göstereceğinden, bu deneyde kullanılan diğer parametreler için lütfen spektrumların elde edildiği metne bakınız. Bu gösterimde, iki farklı spin tuzağı olan demir MGD ve DNPO kullanarak nitrik oksit ve süperoksit radikallerinin tespitini gösteriyoruz.

Endotel hücrelerin kalsiyum iyon dört ile stimülasyonunun nitrik oksit ürettiğini ve görülen bir tedaviyle. Bir perin nitrit donörünün nitrik oksit üretimini azaltabileceğini göstermekteyiz; ancak, bir nitro spin tuzağı varlığında PMA ile nötrofillerin stimülasyonu, başlangıçta oluşan süperoksit adda'nın instabilitesi nedeniyle S oksit yerine bir hidroksil radikali ADDA verir. Demir mg d nitroslar tarafından gerçekleştirilen spin tuzaklama mekanizmaları temel olarak aynı olsa da, nitrik oksidin demir MGD'ye eklenmesi daha hızlı bir reaksiyon hızı içerir ve demir MGD nitrik oksit add formu oldukça stabildir.

Aslında, EPR sinyal yoğunluğunda belirgin bir azalma olmaksızın, EPR spektrumunun daha sonra elde edilebilmesi için çözelti -80 °C'de dondurulabilir. Öte yandan, nitro spin tuzağı kullanılarak oksit tespiti yavaştır. Bu durum, nitrik oksit tespiti için kullanılan karşıt demir MGD'ye kıyasla daha yüksek spin tuzağı konsantrasyonları gerektirmektedir.

Süperoksit addükt formunu başarılı bir şekilde tespit etmek için, bu videoda artık göstermediğimiz çeşitli yaklaşımlar uygulanmıştır. Örneğin, düz hücre kullanımı, daha yüksek hücre yoğunluğu nedeniyle daha iyi süperoksit addükt sinyal yoğunluğu sağlayabilir. Bu konuyla ilgili olarak metne başvurmanızı öneririm.

Ayrıca, DMPO kullanmak yerine, daha kalıcı SU peroksit addüktleri sağlayabilen BMPO ve VMP gibi sertifikalı bir spin tuzağı veya fosforile Nitro DAP MPO kullanılabilir. US tespiti için spin yakalama yöntemi uygulanırken, SU peroksit addüktlerini stabilize etmek amacıyla siklodekstrin kullanımı da tercih edilmiştir. SU süperoksit oluşumunun hemen ardından EP spektrumunun elde edilmesi şiddetle tavsiye edilir.

Bu nedenle, nitrik oksidin demir MGD kullanılarak tespit edilmesi çok daha verimlidir ve süperoksitlerin PR spin yakalama yöntemiyle tespit edilmesinde karşılaşılan temel zorluk, demir MGD nitrik oksit addük oluşumunda gözlemlenen özelliklere ulaşmaktır. Bunlar; hızlı süperoksit reaktivitesi ve stabil addük oluşumudur. Süperokside karşı hızlı reaktiviteye sahip ve stabil spin addükleri oluşturan spin yakalayıcıların geliştirilmesi yönündeki çalışmalar, şu an laboratuvarımızda ve diğer gruplar tarafından da yürütülmektedir.