Sirkülasyon Melanom Hücreler foto akustik flowmetre kullanarak Algılama ve İzolasyonu

Aşağıdaki deneyin amacı, sekonder tümörlerin oluşumundan önce kanserin varlığını tespit etmektir. Bu, öncelikle evre dört melanom hastalarından kan örnekleri alınması ve ayrıştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım olarak kan, melanom hücrelerinin tespitine ve izolasyonuna olanak tanıyan bir fotoakustik akış odasına aktarılır.

Ardından, yakalanan hücrelerin görüntülemesi yapılarak tespit edilen melanomanın varlığı doğrulanır. Sonuçlar, sistemin fotoakustik dalga formları ve hücre görüntüleme tekniklerine dayanarak melanoma hücrelerini doğru ve hızlı bir şekilde tespit etme ve izole etme yeteneğini göstermektedir. Tekniğimizin, R-T-P-C-R, biyomanyetik hücre ayırma ve diğer yöntemler gibi dolaşım yapan melanoma hücrelerini tespit eden mevcut yöntemlere göre temel avantajı, yöntemimizin etiketsiz olması ve dolaşım yapan melanoma hücrelerinin yüzeylerini değiştirmeden veya onları bir substrata sabitlemeden yakalanmasına olanak tanımasıdır.

Metastatik kanser tespiti için bir örnek hazırlamak üzere, dördüncü evre kanser hastasından yaklaşık 10 mililitre tam kan alarak başlayın. İki adet beş mililitrelik vacutainer santrifüj tüpünü 10 dakika boyunca 3000 RPM'de santrifüjleyin. Kan örneği üç farklı katmana ayrılacaktır. Alt katman eritrositlerden oluşur.

Buffy coat olarak da adlandırılan orta katman lökositleri ve melanoma hücrelerini, üst katman ise plazma ve trombositleri içerir. Buffy coat tabakasını bozmadan mümkün olduğunca fazla plazmayı uzaklaştırın. İki mililitrelik Eppendorf tüplerine 250 µL opak His 10 77 ekleyin.

Dokuz inçlik bir pastör pipeti kullanarak kalan plazmayı, Buffy coat tabakasının tamamını ve eritrositlerin üst katmanını çekin. 500 µL'den daha az topladığınızdan emin olun. Çözeltiyi daha önce hazırlanmış wind Trobe tüplerine aktarın.

Kan yeniden ayrışacaktır, ancak bu kez eritrositler hispa ile ayrılacak ve böylece Buffy coat'un kolayca çıkarılmasına izin verecektir. Tüm Buffy coat'u izole etmek için dokuz inçlik bir Pesa pipeti kullanın ve bunu iki mililitrelik bir eend orph tüpüne yerleştirin. Ardından bunu, %2 hacimce hacim oranında 20 ile PBS içeren 1,5 mililitre içerisinde süspande edin.

Bir akış odası oluşturmak için, 20 mm dış çapta ve 17 mm iç çapta, sekiz milimetre uzunluğunda bir akrilik silindir ile başlayın. Ardından, silindirin yan yüzeyine birbirine 90 derecelik açılarla konumlandırılmış üç adet beş milimetre çapında delik açın. Son olarak üç parça polimer tüp kesin ve bunları açılan deliklere yerleştirin.

Sızdırmaz bir conta oluşturmak için akrilik halkanın altına para film gerin. Para film, akrilik halka ile birlikte sığ bir kap oluşturacak ve akış hücresini meydana getirecek olan akrilamid çözeltisini tutacaktır. Birbirine tam karşı konumlanmış tüp parçalarından geçecek şekilde 1,6 milimetre çapında bir teli asın ve halkanın ortasından bakıldığında üçüncü tüp parçasına doğru sadece telin göründüğünden emin olun.

1,6 milimetre çapında bir tel yerleştirin ve tüpü, asılı telden bir milimetre uzağa konumlandırın. Bu teller, akrilamidin tüpün içine girmesini engeller. Beş mililitre akrilamid hazırlayın.

Ardından karışımı hızlıca akrilik halkaya dökerek üst kısmına kadar doldurun. Birkaç saniye sonra solüsyon jelleşecektir. Akış odası kalıbı oluştururken, akrilamid jeli bozmamaya dikkat ederek telleri dikkatlice çekin; böylece silindirik bir akış yolu ve akış yoluna odaklanmış bir optik fiber yerleştirmek için bir alan bırakmış olursunuz.

Akış odası, akustik olarak ultrason jeli kullanılarak kullanıma hazır hale getirilmiştir. Bir poliviniliden florür piezoelektrik akustik transduseri, akış yolunun hemen üzerine gelecek şekilde akış odasına bağlayın. Bayonet konnektör veya BNC kablo kullanarak, transduseri bir geniş bant alıcının girişine bağlayın.

Osiloskopu tetiklemek için filtrenin çıkışını osiloskoba bağlayın. Transdüserin yakınına bir fotodiyot yerleştirin ve onu bir B NNC kablosuyla osiloskoba bağlayın. Küçük bir hava cebi oluşana kadar akış odasının küçük tüpünü dışarı çekin ve transdüser ile birleştirin.

Ardından optik fiberi yerleştirin ve arayüz sinyallerini azaltmak ve akış yoluna uygulanan lazer ışığı miktarını artırmak için cebi suyla doldurun. Optik fiberin sayısal açıklığı ve akış yoluna olan kısa mesafe nedeniyle, lazer herhangi bir zamanda yalnızca tek bir numune dilimini ışınlayacak ve böylece lazerin hemen önündeki numunenin, fotoakustik sinyalleri oluşturan numuneyle aynı olmasını sağlayacaktır.

Ardından, akış hücresinin bir koluna bir T konnektörü ve konnektörün diğer kollarına iki şırınga pompası bağlayın. Şırıngalardan biri hava, diğeri ise daha önce hazırlanmış hücre süspansiyonu içermelidir. Daha sonra her iki şırınga pompasını çalıştırın.

İki kabul edilebilir akışkan T eklemine ulaştığında, homojen sluglara ayrılacaklar ve transduserin yanından akacaklardır. Melanoma hücrelerinde fotoakustik dalgalar oluşturmak için akan numuneyi nanosaniye darbeli bir lazerle ışınlayın. Melanin geniş bantlı bir optik soğurucu olduğundan, herhangi bir görünür lazer dalga boyu kullanılabilir.

Bir sülük transduserin üzerindeyken osiloskopta beliren bir sinyal, sülüğün melanoma içerdiğini gösterir. Sülüğü toplama tüpüne bırakmadan önce sistem boyunca takip edin. İmmünositokimya için numuneleri hazırlamak amacıyla, cam lamları sitohunilere yerleştirin ve yakalanan hücrelerin cam lamlara yapışmasına yardımcı olmak için sitosporun içine yükleyip santrifüjleyin.

Her bir huniye 100 µL %1 BSA içeren PBS ekleyin. Ardından üç dakika boyunca 600 RPM'de santrifüj edin. Santrifüj işleminden sonra, CyTOF hunileri için hücre örneklerini ekleyin ve ardından üç dakika boyunca 600 RPM'de santrifüj edin.

Lamlar üzerine etanol bazlı bir fissküratif püskürtün. Ardından, spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için lamları iki kez 10 dakika boyunca PBS ile yıkayın. Her bir lamı, 10 µL keçi serumu ve 90 µL PBS karışımı ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından lamları boşaltın ve primer antikor solüsyonunu ekleyin. Her lam; PBS içerisinde %1 rabbit mark, bir adet %1 mouse CD 45 ve %10 goat serum içermeli; oda sıcaklığında, nemlendirilmiş bir bölmede bir saat boyunca inkübe edilmelidir. Ardından, lamları PBS ile üç kez 10 dakika boyunca yıkayın.

Ardından, lamları uygun floresan sekonder antikorlar ile karanlıkta, oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin ve lamlardaki sıvıyı dökün. Daha sonra, çekirdekleri boyamak için lamları PBS içinde beşer dakikalık üç yıkama işleminden geçirin, hücreleri 0,1 µg/mL DPI ile bir dakika boyunca inkübe edin. Sonrasında lamlardaki sıvıyı dökün ve PBS ile yıkayın.

Son olarak, reçine bazlı bir montaj ortamı kullanarak hücre örneğinin üzerine bir lamella yerleştirin, lamellayı şeffaf oje ile mühürleyin ve floresan mikroskop ile görüntüleyin. Beyaz kan hücrelerinden ve melanoma hücrelerinden gelenle fotoakustik dalga formları burada solda gösterilmiştir. Kendine özgü pigmentasyonu olmayan beyaz kan hücreleri fotoakustik dalga üretmezler ve sağda elektronik gürültüden oluşan düz bir çizgi şeklinde görünürler.

Bununla birlikte, pigmente melanoma hücreleri güçlü bir fotoakustik dalga üretirler. İmmünositokimya ve kimyasal boyama sonrası, kültürlenmiş melanoma hücreleri mavi renkte benekli sinyaller verir; DPI için üst üste bindirilmiş görüntülerde işaretli olanlardan biri yeşil ile vurgulanmış, lökositlerin bir göstergesi olarak CD 45 ile işaretli olan ise belirtilmiştir. Bu şekil, gelişiminin ardından birkaç beyaz kan hücresi arasındaki melanoma hücrelerini göstermektedir.

Tekniğimiz, kanser tespiti alanındaki araştırmacıların, hem kanser tespitini geliştirmek hem de nihayetinde ölümcül yayılımını tedavi etmek amacıyla metastaz fenomenini keşfetmelerinin önünü açacaktır.